Activación de ECA2 para el tratamiento de enfermedades cardíacas, pulmonares y renales e hipertensión.

Un kit de genotipado de la ECA2 que comprende un agente de detección de la presenica de un polimorfismo en un solo nucleótido de la ECA2 seleccionado del grupo de ECA2a-ECA2m en una muestra de ácido nucleico derivada de un animal,

preferentemente un ser humano, en el que ECA2a a ECA2m son los polimorfismos en un solo nucleótido descritos en las secuencias de nucleótidos de las SEC ID Nº 5 a 18 y que además comprende una placa que tiene una pluralidad de pocillos y que tiene unidas a los mismos sondas que tienen una secuencia de ácido nucleico que se une específicamente a una secuencia de ECA2 que incluye dicho polimorfismo en un solo nucleótido de ECA2

Activación de ECA2 para el tratamiento de enfermedades cardíacas, pulmonares y renales e hipertensión Campo de la invención La presente divulgación proporciona composiciones y procedimientos para su uso en el diagnóstico y tratamiento de enfermedades cardíacas, pulmonares y renales, incluyendo hipertensión, enfermedad cardíaca coronaria, insuficiencia cardíaca y renal, edema pulmonar, y lesión pulmonar, tal como en el choque tóxico o la ventilación artificial.

Antecedentes de la invención La enfermedad cardiovascular será la mayor carga social de cuidados sanitarios del siglo 21, y se predice que sea la causa más común de muerte en todo el mundo en 2020. Un factor de riesgo principal de la enfermedad cardíaca es la alta presión sanguínea. La hipertensión es un carácter cuantitativo multifactorial controlado tanto por factores genéticos como ambientales.

Mientras se conoce mucho acerca de los factores ambientales que pueden contribuir a la alta presión sanguínea, tales como la dieta y actividad física, se conoce menos sobre los factores genéticos que son responsables de la predisposición a enfermedades cardiovasculares. A pesar de la identificación de varios loci de carácter cuantitativo genético supuestos (QTL) asociados a la hipertensión en modelos animales, ninguno de estos loci se han traducido en genes. De este modo, los mecanismos moleculares y genéticos que subyacen a la hipertensión y otras enfermedades cardiovasculares siguen siendo desconocidos en gran medida.

Un regulador crucial de la homeostasis de la presión sanguínea es el sistema renina - angiotensina (RAS) . La protease renina escinde el angiotensinógeno en el péptido angiotensina I (AngI) decamérico inactivo. La acción de la enzima conversora de angiotensina (ECA) después cataliza la escisión de la Angl en la angiotensina II (AngII) octómera activa, que puede contribuir a la hipertensión promoviendo la vasoconstricción vascular del músculo liso y la reabsorción de sodio del túbulo renal. Los ratones mutantes ECA muestran hipotensión espontánea, infertilidad masculina parcial, y malformaciones renales. En los seres humanos, un polimorfismo ECA se ha asociado a determinantes de función renal y cardiovascular, y la inhibición farmacológica de ECA y receptores de AngII son eficaces en la reducción de la presión sanguínea la reducción de la presión sanguínea y enfermedad renal. Además, la inhibición de ECA y los receptores de Angll tienen efectos beneficiosos en la insuficiencia cardíaca.

Recientemente se ha identificado un homólogo de ACE, denominado ECA2, que se expresa predominantemente en las células endoteliales vasculares del riñón y corazón. De manera interesante, dos homólogos de ECA también existen en las moscas. De manera similar las funciones de ACE, ECA2 como una carboxipeptidasa, que escinde un único resto de AngI, que genera Ang1-9, y un único resto de AngII para generar Ang1-7. Estos datos bioquímicos in vitro sugieren que, ECA2 modula el RAS y de este modo desempeñan un papel en la regulación de la presión arteria. No se conoce el papel in vivo de la ECA2 en el sistema cardiovascular y el RAS.

Acton et al., en la Patente de Estados Unidos Nº 6.194.556 , describe el uso de ECA2 en la diagnosis y terapéutica de los estados asociados a ECA2. La patente estableció que los niveles de expresión ECA2 se incrementan con la hipertensión y de este modo los antagonistas o inhibidores de ECA2 serían útiles en el tratamiento de un incremento de la presión sanguínea o trastornos relacionados. La solicitud de patente canadiense nº 2.372.387 proporciona ejemplos específicos de inhibidores de ECA2 que, se pretende que sean útiles para el tratamiento de enfermedad cardíaca enfermedad cardíaca, tal como hipertensión. Esto de nuevo enfatiza la necesidad de inhibir, en lugar de incrementar, la actividad de ECA2. Estas referencias, que enseñan la necesidad de inhibir la actividad de ECA2, se basan solamente en los datos experimentales in vitro. No proporcionan datos in vivo, tales como los datos de mamíferos inactivados, para caracterizar ECA2. Hasta la fecha, no se ha aprobado ningún inhibidor de ECA2 como compuesto farmacéutico para el tratamiento de hipertensión. Además, el papel in vivo de ECA2 en el sistema cardiovascular y el RAS permanece en gran medida desconocido. Permanece una necesidad de caracterizar la función de ECA2 con el fin de sea capaz de diseñar ensayos de diagnóstico apropiados y compuestos farmacéuticos para el tratamiento de enfermedad cardíaca y renal.

Sumario de la invención La invención proporciona un nuevo paradigma para la regulación del sistema renina - angiotensina y muestra un uso completamente nuevo e inesperado de la ECA2, en contraste con la predicción basada en los datos in vitro (patente de Acton) e imprevista en la técnica anterior, como regulador negativo crucial del RAS requerido para la función cardiaca y el control de la presión arterial. La activación de la ECA2 es crucial para el tratamiento y la prevención de enfermedad cardíaca, pulmonar y renal. La divulgación muestra la primera vez que la administración de un activador de la ECA2 a un animal previene y trata la hipertensión y la enfermedad cardíaca y renal, y la lesión pulmonar.

Breve descripción de las figuras Las realizaciones preferidas de la invención se describirán en relación con las figuras, en las que:

Figura 1. Secuencia y mapeo cromosómico de la ECA2 de rata.

a, Alineación de la proteína ECA2 de rata, de ratón y de ser humano, con ECA de testículos humanos y de ratón (T-ECA) . La parte sombreada en negro indica la identidad de aminoácidos y la parte sombreada en gris indica el grado de similitud de aminoácidos. b, Estructura esquemática del dominio de la ECA y la ECA2. Hay que observar que la ECA2 solo contiene un dominio de la ECA con el sitio consenso de unión a cinc HEMGH. Los centros catalíticos se indican en negro, el péptido señal se indica en gris y el dominio transmembrana en líneas discontinuas. c, Patrones de expresión de los genes de la ECA2 de rata y ratón en tejidos adultos diferentes y días diferentes de desarrollo embrionario (E7 = día embrionario 7) . Hay que observar que están presentes dos isoformas para ECA2 en ratones, pero no en rato o ser humano (no mostrado) , una característica similar a la observada para ACE15. d, Resultados de mapa de híbrido de radiación de ECA2 de rata, comparado con el mapa de QTL identificado en los animales sensibles a sal ratas Sabra (SS-X) , SHRSP (BP3) , y SHR (BB.Xs) . Los nombres de los marcadores polimórficos se indican a la izquierda del ideograma. Se muestran las puntuaciones de LOD y los valores theta para los marcadores unidos a la ECA2. cR = centiRads.

Figura 2. Niveles de expresión de la ECA2 en modelos de ratas de hipertensión.

a, análisis de transferencia de tipo Northern del ARNm de la ECA2 de riñones de ratas Sabra SBH/y y SBN/y. La sección anterior muestra la representación de transferencias de Northern con niveles de control de actina. El panel inferior muestra los niveles drelativos de mensaje de ECA2 normalizado para los niveles de actina. b, Análisis de transferencia de Western de los nivel proteína de ECA2 de riñones de Sabra SBH/y y sus ratas control SBN/y, así como SHR y SHRSP y sus ratas control WKY. La sección superior muestra transferencias de Western representativas. Se indica la presión sanguínea sistólica (BP) en mmHg para las respectivas ratas Sabra. El panel inferior muestra los niveles de proteína relativos de ECA2 corregidos para actina. Las barras muestran los valores medios +/- ETM. * = p lt; 0, 05, ** = p lt; 0, 01. (n = 4, para todos los grupos) .

Figura 3. Rotura dirigida de la ECA2 de ratón mediante recombinación homóloga.

a, Estrategia de dirección de genes. Se muestra una parte del locus de tipo salvaje de ECA2 murino (parte superior) . Los recuadros en negro indican exones. El vector de dirección se diseñó para reemplazar el exón 9 que codifica el dominio catalítico de unión a cinc con el módulo del gen de resistencia a neomicina (neo) colocado en la orientación de sentido contrario. Se usó la timidita quinasa (TK) para la selección negativa. Las sondas flanqueantes de 3’ y 5’ usadas para los análisis de Southern se indican con un recuadro de línea discontinuo. b, análisis de transferencia Southern de células ace+Y y ace´ ES. Se digirió el ADN genómico con EcoRI y se hibridizó con la sonda flanqueante de 3’ y 5’ mostrada en (a) . c, Análisis de transferencia de Western de la proteína de expresión de ECA2 en los riñones de ratones eca2 ace´. El anti-ECA2 Ab es reactivo con una región N-terminal a la supresión. d, análisis de RT-PCR de la expresión... [Seguir leyendo]

1. Un kit de genotipado de la ECA2 que comprende un agente de detección de la presenica de un polimorfismo en un solo nucleótido de la ECA2 seleccionado del grupo de ECA2a-ECA2m en una muestra de ácido nucleico derivada de un animal, preferentemente un ser humano, en el que ECA2a a ECA2m son los polimorfismos en un solo nucleótido descritos en las secuencias de nucleótidos de las SEC ID Nº 5 a 18 y que además comprende una placa que tiene una pluralidad de pocillos y que tiene unidas a los mismos sondas que tienen una secuencia de ácido nucleico que se une específicamente a una secuencia de ECA2 que incluye dicho polimorfismo en un solo nucleótido de ECA2

2. El kit de la reivindicación 1, en el que el agente de detección comprende un ácido nucleico y/o una enzima de restricción.

3. El kit de la reivindicación 1 o 2, que además comprende un agente de amplificación para amplificar el ácido nucleico.

4. El kit de la reivindicación 3, en el que el agente de amplificación comprende un primer conjunto, en el que cada cebador es un ácido nucleico que se une específicamente próximo a, y produce la elongación a través de, uno de ECA2a-ECA2m .

5. Un procedimiento de genotipado de la ECA2 en un animal que es un ser humano, que comprende detectar una región de un ácido nucleico de ECA2 que incluye un polimorfismo en un solo nucleítido de ECA2 en la muestra de ácido nucleico de ECA2 derivada del animal, que incluyen regiones cadena arriba y cadena abajo de la región de codificación de la ECA2, en el que el genotipo de ECA2 se usa para determinar si el animal tiene una enfermedad de disminución de la ECA2 o está en riesgo de sufrirla, preferentemente una enfermedad cardiovascular o una enfermedad renal o una enfermedad pulmonar o una enfermedad que afecta a los vasos sanguíneos, en el que el polimorfismo nucleotídico se selecciona del grupo que consiste en ECA2a-ECA2m, en el que de ECA2a a ECA2m son los polimorfismos de un solo nucleótido descritos en las secuencia de nucleótidos de las SEC ID Nº 5 a 18.

6. El procedimiento de la reivindicación 5, que comprende determinar si el ser humano es homocigoto o heterocigoto para el polimorfismo de ECA2.

7. El procedimiento de la reivindicación 5 o 6, en el que la etapa de detección comprende determinar la secuencia de nucleótidos del ácido nucleico de la ECA2.