Procedimiento para la determinación de la actividad de ACE2.

Procedimiento para la determinación de la actividad de la ACE2,

que comprende las siguientes etapas:

* facilitar unidades que se unen a ACE2 inmovilizadas en un soporte sólido, que son específicas para unaparte de la ACE2 que no está implicada en la actividad catalítica de ACE2,

* poner en contacto las unidades que se unen a ACE2 inmovilizadas con una muestra que posiblementecontiene la ACE2, uniéndose la ACE2 por la unidad que se une a ACE2, seleccionándose la muestra delíquidos corporales (tal como sangre completa, suero o plasma), muestras de tejido fluidas homogeneizadasy sobrenadantes de cultivo celular,

* eliminar mediante lavado la proporción no unida de la muestra de la ACE2 unida a las unidades que seunen a ACE2,

* añadir un sustrato de la ACE2 que se convierte mediante la actividad de ACE2 y la conversiónproporciona una señal,

* medir la modificación de la señal en un intervalo de tiempo determinado, pudiéndose correlacionar lamodificación con la actividad de ACE2,

en el que la unidad que se une a ACE2 es un anticuerpo que se une a la parte de extremo C terminal deldominio extracelular de ACE2 natural y es específico para una secuencia parcial de al menos 4aminoácidos consecutivos de los 362 aminoácidos del extremo C terminal de ACE2.

Procedimiento para la determinación de la actividad de ACE2

La presente invención se refiere a la determinación inmunológica de la actividad enzimática de enzimas.

Los procedimientos actuales para la determinación de actividades enzimáticas en procedimientos de cribado rápidos se ven influidos fuertemente por factores interferentes de diversas fuentes. Los ensayos habituales para la medición de actividades enzimáticas prevén el uso de compuestos fluorescentes o cromógenos. Por ejemplo en la detección de proteasa del VIH se usa un sustrato fluorescente que se modificó con un grupo dansilo fluorescente en un extremo del péptido y un inhibidor de la fluorescencia en el otro extremo del péptido. Un aumento de la señal de fluorescencia medida se realiza rompiendo el péptido mediante la proteasa, dado que la parte emisora del inhibidor supresor se divide. Algunos sustratos fluorescentes para otras enzimas pueden modificarse mediante modificaciones similares de los sustratos de la respectiva enzima, tal como se dan a conocer por ejemplo en los documentos US 6.037.137, EP 1 557 474 A y WO 90/00618.

Estos ensayos, particularmente en el área de alto rendimiento, son propensos a dar problemas con la autofluorescencia de componentes biológicos, en parte de manera condicionada por las propias moléculas medidas. Muchos de los compuestos y extractos naturales son incluso de colores o fluorescen y se encuentran en solución durante la medición de la señal del ensayo. Esto conduce a que esta interferencia limita la detección y la sensibilidad

o la zona de medición dinámica del procedimiento. La interferencia puede interpretarse también como inhibición de la enzima, siendo difícil en el ensayo de inhibición diferenciar la inhibición medida de la inhibición (bio) química real de la enzima.

El documento US 5.591.591 describe un ensayo para la detección de proteasas, en el que se añade un componente de dioxetano con un aminoácido específico de enzima proteolítica o un péptido unido a una muestra que contiene posiblemente la proteasa, en el que el aminoácido se separa mediante la reacción enzimática, lo que produce a su vez la degradación del dioxetano y quimioluminiscencia.

El documento JP 8160046 se refiere al uso de un kit para la determinación de la actividad de ACE.

El documento WO 2002/098448 A1 se refiere a compuestos que se unen específicamente a ACE2 y modifican su actividad.

El documento US 2003/0124622 describe la medición de la actividad de una proteasa, uniéndose la proteasa inicialmente a un anticuerpo inmovilizado y añadiéndose un sustrato cromógeno que cambia de color con la acción de la actividad enzimática. La modificación de la extinción puede correlacionarse con la actividad enzimática.

El documento US 6.610.497 describe el aislamiento de ACE2 y menciona también una pluralidad de posibilidades para la determinación de ACE2 o complejos de ACE2-componente de unión.

El documento US 2005/0287066 A1 se refiere a anticuerpos monoclonales que se unen específicamente al dominio N de ACE, o sea no a ACE2.

Guy et al. (Biochemistr y 42 (45) (2003) : 13185-13192) describen la actividad y la especificidad de ACE2.

Vickers et al. (Biological Chemistr y 277 (17) (2002) : 14838-14843) mencionan información antecedente con respecto a ACE2 y describen también sustratos para la medición de la actividad de ACE2.

Es un objetivo desarrollar sistemas de medición rápidos que no se vean influidos por impurezas, particularmente para sistemas para la medición rápida de actividades enzimáticas.

La presente invención se refiere a un procedimiento para la determinación de la actividad de ACE2, de una enzima del sistema renina-angiotensina-aldosterona, que comprende las siguientes etapas:

• facilitar unidades que se unen a ACE2 inmovilizadas en un soporte sólido, que son específicas para una parte de ACE2 que no está implicada en la actividad catalítica de ACE2,

• poner en contacto las unidades que se unen a ACE2 inmovilizadas con una muestra que contiene posiblemente ACE2, uniéndose la ACE2 por la unidad que se une a ACE2,

• eliminar la proporción no unida de la muestra de la enzima unida a las unidades que se unen a ACE2,

• añadir un sustrato de ACE2 que se convierte mediante actividad enzimática y la conversión proporciona una señal,

• medir la modificación de la señal en un intervalo de tiempo determinado, pudiéndose correlacionar la modificación con la actividad de ACE2.

Con el procedimiento según la invención es posible determinar cuantitativamente la actividad enzimática en soluciones complejas, tales como líquidos corporales o sobrenadantes de cultivo, mediante el uso de la actividad endógena de la enzima que va a cuantificarse con la conversión de un sustrato que proporciona señales.

Para la determinación directa de enzimas activas en soluciones complejas, tales como líquidos corporales, se construyó un procedimiento que combina dos etapas esenciales y permite una alta producción de muestras: la unión inmunológica de la enzima a un soporte, tal como por ejemplo una placa de microtitulación, de manera que se consigue la reducción de todos los otros componentes, seguida de una reacción enzimática específica a base de un sustrato marcado con fluorescencia que proporciona una señal medible.

En la primera etapa se incuba la solución compleja por ejemplo en una placa de microtitulación, en la que se inmovilizó anteriormente por ejemplo un anticuerpo específico de ACE2. Un anticuerpo de este tipo reconoce preferentemente una parte de la enzima que no está implicada en la reacción catalítica, y no altera la reacción enzimática. Cuando el anticuerpo reconoce, por el contrario, regiones de la enzima que están implicadas directamente en la reactividad enzimática, se reduce la sensibilidad del ensayo o el ensayo ya no funciona, dado que está bloqueada la actividad enzimática. Todos los componentes adicionales de la muestra compleja (por ejemplo suero) no se unen al soporte sólido, por ejemplo una superficie de placa, y se separan en una etapa posterior del sistema, preferentemente se lavan de la placa. Las etapas de lavado pueden repetirse eventualmente, por ejemplo 1, 2, 3 o varias veces. Finalmente queda exclusivamente la enzima unida de manera correcta en la placa. Tras la adición de un sustrato marcado con fluorescencia que se rompe mediante la enzima y el estado roto presenta una fluorescencia claramente superior, se mide tras un tiempo de incubación definido la fluorescencia y se compara con un patrón de actividad y una concentración conocidos. Habitualmente se consigue esto mediante sistemas de inhibición de la fluorescencia de dos componentes, en los que se eleva la fluorescencia mediante la ruptura del inhibidor.

Mediante la acción o la conversión de la enzima sobre el sustrato se modifica éste preferentemente en la extinción o fluorescencia que puede medirse con procedimientos ópticos. Ciertos sustratos cromógenos que pueden modificarse para un fin de este tipo para observar una modificación de la extinción (o absorción) se conocen por ejemplo a partir del documento US 2003/0124622. En otras formas de realización, el sustrato presenta una parte fluorescente y una parte inhibidora de la fluorescencia que pueden separarse mediante la actividad enzimática. Mediante la conversión por la enzima puede observarse y medirse por tanto una modificación de la fluorescencia.

La unidad que se une a ACE2 es preferentemente un anticuerpo o un receptor sintético o natural de la enzima que no impide la actividad de ACE2.

La enzima determinada según la invención es ACE2, una peptidasa o proteasa del sistema renina-angiotensinaaldosterona (RAAS) , también denominada sistema renina-angiotensina (RAS) . La actividad proteolítica de RAS representa una cascada de etapas enzimáticas para la regulación de la tensión arterial. ACE (enzima convertidora de angiotensina) es en este caso la enzima mejor conocida que convierte angiotensina I en angiotensina II. La angiotensina II actúa aumentando la tensión arterial, por lo que con frecuencia se usan inhibidores de ACE para el tratamiento de tensión arterial elevada. Inmediatamente tras el descubrimiento de ACE2 se supuso que debía presentar la misma actividad que ACE (US 6.194.556) , por lo que se denominó según esta enzima. Tanto ACE como ACE2 son metaloproteasas con un átomo de zinc catalítico en el centro. Diese supuesto, sin embargo, resultó ser erróneo. Tanto por la actividad como por su mecanismo, ACE y ACE2 son completamente distintas. Mientras que ACE actúa aumentando la tensión arterial, ACE2 provoca una disminución de la... [Seguir leyendo]

1. Procedimiento para la determinación de la actividad de la ACE2, que comprende las siguientes etapas:

• facilitar unidades que se unen a ACE2 inmovilizadas en un soporte sólido, que son específicas para una parte de la ACE2 que no está implicada en la actividad catalítica de ACE2,

• poner en contacto las unidades que se unen a ACE2 inmovilizadas con una muestra que posiblemente contiene la ACE2, uniéndose la ACE2 por la unidad que se une a ACE2, seleccionándose la muestra de líquidos corporales (tal como sangre completa, suero o plasma) , muestras de tejido fluidas homogeneizadas y sobrenadantes de cultivo celular,

• eliminar mediante lavado la proporción no unida de la muestra de la ACE2 unida a las unidades que se unen a ACE2,

• añadir un sustrato de la ACE2 que se convierte mediante la actividad de ACE2 y la conversión proporciona una señal,

• medir la modificación de la señal en un intervalo de tiempo determinado, pudiéndose correlacionar la modificación con la actividad de ACE2, en el que la unidad que se une a ACE2 es un anticuerpo que se une a la parte de extremo C terminal del dominio extracelular de ACE2 natural y es específico para una secuencia parcial de al menos 4 aminoácidos consecutivos de los 362 aminoácidos del extremo C terminal de ACE2.

2. Procedimiento según la reivindicación 1, caracterizado porque el sustrato se modifica en la extinción o fluorescencia, en el que preferentemente el sustrato presenta una parte fluorescente y una parte inhibidora de la fluorescencia que pueden separarse mediante la actividad de ACE2.

3. Procedimiento según una de las reivindicaciones 1 ó 2, caracterizado porque la enzima ACE2 se selecciona de ACE2 unida a membrana (mACE2) y ACE2 segregada (seACE2) .

4. Procedimiento según una de las reivindicaciones 1 a 3, caracterizado porque la unidad que se une a ACE2 es específica para una parte de al menos 4 aminoácidos, preferentemente 5, 6, 7 u 8 aminoácidos de ACE2, que presenta una distancia mínima de 0, 5 nm, preferentemente 0, 6 nm, de manera especialmente preferente 0, 7 nm o 0, 8 nm, particularmente 0, 9 nm o 1, 0 nm del centro activo.

5. Procedimiento según una de las reivindicaciones 1 a 4, caracterizado porque el sustrato es un péptido de bajo peso molecular con una longitud de 1 a 30 aminoácidos, preferentemente de 1 a 20 aminoácidos, de manera particularmente preferente de 1 a 10 aminoácidos, que puede ser roto por ACE2 y está unido covalentemente a un producto de ruptura que va esperarse de la parte fluorescente y a otro producto de ruptura que va a esperarse del inhibidor, preferentemente Mca-Ala-Pro-Lys (Dnp) -OH.

6. Procedimiento según una de las reivindicaciones 1 a 5, caracterizado porque la muestra contiene impurezas cromóforas y/o fluorescentes.

7. Uso de un procedimiento según una de las reivindicaciones 1 a 6 para la determinación in vitro de títulos de ACE2 en muestras de sangre completa, suero o plasma.