Ácidos nucleicos de unión a MCP-1.

Un ácido nucleico L capaz de unirse a MCP-1, en donde el ácido nucleico comprende en la dirección 5'->3' unaprimera extensión Caja B1A,

una segunda extensión Caja B2 y una tercera extensión Caja B1B, en donde

la primera extensión Caja B1A comprende una secuencia de nucleótidos seleccionada del grupo que consiste enACGCA, CGCA y GCA,

la segunda extensión Caja B2 comprende una secuencia de nucleótidos de

CSUCCCUCACCGGUGCAAGUGAAGCCGYGGCUC,y

la tercera extensión Caja B1B comprende una secuencia de nucleótidos seleccionada del grupo que comprendeUGCGU, UGCG y UGC.

Ácidos nucleicos de unión a MCP-1

La presente invención se refiere a un ácido nucleico L que es capaz de unirse a MCP-1, a una composición farmacéutica que comprende el ácido nucleico, al uso del ácido nucleico para la fabricación de un medicamento, al

uso del ácido nucleico para la fabricación de un medio de diagnóstico, a un complejo que comprende una quimiocina y el ácido nucleico, al uso del ácido nucleico para la detección de una quimiocina, a un método para el escrutinio de un agonista de quimiocina y/o un antagonista de quimiocina, a un kit para la detección de una quimiocina que comprende el ácido nucleico, y a un método para la detección del ácido nucleico en una muestra.

La MCP-1 humana (proteína quimiotáctica de monocitos 1; nombres alternativos, MCAF [factor quimiotáctico y activador de monocitos]; CCL2; SMC-CF [factor estimulante de la colonia de células de músculo liso]; HC-11; LDCF; GDCF; TSG-8; SCYA2; A2; código de acceso SwissProt, P13500) ha sido caracterizada por tres gruposindependientes (Matsushima 1988; Rollins 1989; Yoshimura 1989) . Ésta consiste en 76 aminoácidos y pone de relieve un sitio de unión a heparina como todas las quimiocinas. Los dos puentes de disulfuro intramoleculares confieren a la molécula una estructura rígida, estable. Además, la MCP-1 porta un piroglutamato en su extremo amino. En la Thr 71, se localiza un sitio potencial de glicosilación unido a O. Existen miembros adicionales de la familia MCP tanto en seres humanos (MCP-2, -3, -4) como en ratones (MCP-2, -3, -5) . Las proteínas humanas son homólogas en aproximadamente un 70% a la MCP-1 humana.

La estructura de la MCP-1 ha sido dilucidada mediante RMN (Handel 1996) y rayos X (Lubkowski 1997) . El monómero de MCP-1 tiene el típico pliegue de las quimiocinas en donde las cisteínas amino-terminales van seguidas de un bucle largo que produce tres láminas plegadas enf antiparalelas en un motivo de llave griega. La proteína finaliza en una hélice a que se superpone a las tres láminas f (código de acceso PDB 1DOK) .

Si bien las estructuras tridimensionales de las formas de MCP-1 de diferentes especies de mamíferos generalmente se han mantenido, la secuencia de aminoácidos no se ha conservado particularmente bien en la evolución. Los resultados del alineamiento de secuencias demuestran una semejanza de secuencia global del 55% entre MCP-1

humana y murina (también llamada JE) dentro de los primeros 76 aminoácidos. Aparte de la secuencias de aminoácidos, la MCP-1 murina difiere de la MCP-1 humana en el tamaño molecular (125 aminoácidos) y en el grado de glicosilación. La MCP-1 murina contiene un dominio carboxiterminal de 49 aminoácidos que no está presente en la MCP-1 humana y que no es requerido para la bioactividad in vitro. La MCP-1 humana comparte los siguientes porcentajes de aminoácidos idénticos con la MCP-1 de:

• Macaca mulatta (mono Rhesus) MCP-1 97%

• Sus scrofa (cerdo) MCP-1 79%

• Equus caballus (caballo) 78%

• Canis familiaris (perro) MCP-1 76%

• Or y ctolagus cuniculus (conejo) MCP-1 75% 35 • Bos Taurus (bovino) 72%

• Homo sapiens MCP-3 71%

• Homo sapiens Eotaxina 64%

• Homo sapiens MCP-2 62%

• Mus musculus (ratón) MCP-1 55%

• Rattus norvegicus (rata) MCP-1 55%

Dado este alto grado de divergencia puede ser necesario generar antagonistas de la MCP-1 de roedores para la realización exitosa de estudios farmacológicos en modelos de roedores.

La MCP-1 es una potente atractora de monocitos/macrófagos, basófilos, células T activadas y células NK. Una amplia variedad de tipos celulares expresan MCP-1, tales como células endoteliales, células epiteliales, fibroblastos,

queratinocitos, células sinoviales, células del mesangio, osteoblastos, células del músculo liso, además de una multitud de células tumorales (Baggiolini 1994) . Su expresión está estimulada por varios tipos de agentes proinflamatorios tales como IL-1f, TNF-a, IFN-y, LPS (lipopolisacáridos) y GM-CSF.

Bastante inusual en la promiscua estructura de la quimiocina, la MCP-1 es muy específica en su uso como receptor, se une solo al receptor de quimiocina CCR2 con alta afinidad. Como todos los receptores de quimiocina, el CCR2 es un GPCR (Dawson 2003) . El CCR2 parece expresarse en dos formas ligeramente diferentes debido a la división alternativa del ARNm que codifica la región carboxiterminal, CCR2a y CCR2b (Charo 1994) . Estos receptores se expresan en monocitos, células precursoras mieloideas y células T activadas (Myers 1995; Qin 1996) . La constante de disociación del MCP-1 al receptor transfectado en las células HEK-293 es de 260 pM, lo que está de acuerdo con los valores medidos en monocitos (Myers 1995; Van Riper 1993) . La activación de CCR2b en células HEK-293 55 transfectadas con MCP-1 inhibe la adenilil ciclasa a una concentración de 90 pM, y moviliza el calcio intracelular a concentraciones ligeramente superiores, aparentemente de forma independiente a la hidrólisis de fosfatidil inositol. Los efectos en la adenilil ciclasa y en la liberación de calcio intracelular son fuertemente inhibidos por la toxina de la tosferina, lo que implica la participación de las proteínas G heterotriméricas de tipo Gi en la transducción de señales (Myers 1995) .

La MCP-1 está involucrada en el reclutamiento de monocitos en los tejidos inflamados. Allí, los macrófagos residentes liberan quimiocinas tales como MCP-1 y otras, y citocinas como TNF, IL-1f y otras, que activan a las células endoteliales para que expresen una batería de moléculas de adhesión. El endotelio “pegajoso” resultante hace que los monocitos de los vasos sanguíneos lleguen a su superficie. Aquí, los monocitos encuentran a la MCP-1 presente en la superficie endotelial, que se une al CCR2 de los monocitos y los activa. Esto finalmente conduce al frenado estricto, la propagación de monocitos por todo el endotelio y la transmigración al tejido circundante, donde los monocitos se diferencian en macrófagos y migran hacia el sitio de concentración máxima de MCP-1.

La MCP-1 es un miembro de la familia de las quimiocinas que es una familia de moléculas pequeñas (aproximadamente 8-14 kDa) principalmente básicas y relacionadas estructuralmente que se unen a heparina. Se forman predominantemente en tejidos inflamados y regulan el reclutamiento, la activación y la proliferación de células sanguíneas blancas (leucocitos) (Baggiolini 1994; Springer 1995; Schall 1994) . Las quimiocinas inducen selectivamente la quimiotaxis de neutrófilos, eosinófilos, basófilos, monocitos, macrófagos, mastocitos, células T y B. Además de su efecto quimiotáctico, pueden ejercer selectivamente otros efectos en células sensibles, como cambios en la forma, aumento transitorio en la concentración de iones de calcio intracelular libre, desgranulación, regulación por aumento de las integrinas, formación de lípidos bioactivos tales como leucotrienos, prostaglandinas, tromboxanos o estallido respiratorio (liberación de especies de oxígeno reactivo para la destrucción de los organismos patógenos o células tumorales) . De este modo, al provocar la liberación de mediadores proinflamatorios adicionales, la quimiotaxis y extravasación de leucocitos hacia los sitios de infección o inflamación, las quimiocinas desencadenan la escalada de la respuesta inflamatoria.

En base a la disposición de los dos primeros, de cuatro, residuos conservados de cisteína, las quimiocinas se dividen en cuatro clases: CC o f-quimiocinas en las que las cisteínas están en tándem, CXC o a-quimiocinas, donde están separadas por un residuo de aminoácido adicional, XC o -quimiocinas con la linfotactina como único y representante hasta la fecha, que poseen un único puente de disulfuro, y quimiocinas CX3C, que se caracterizan por tres residuos de aminoácidos entre las cisteínas, siendo la fractalquina unida a membrana el único miembro de la clase conocido hasta la fecha (Bazan 1997) .

Las quimiocinas CXC actúan principalmente sobre neutrófilos, en particular las quimiocinas CXC que portan la secuencia de aminoácidos ELR en sus extremos amino. Los ejemplos de quimiocinas CXC que son activas sobre neutrófilos son IL-8, GROa, -f, y –y, NAP-2, ENA-78 y GCP-2. Las quimiocinas CC actúan sobre una mayor variedad de leucocitos, tales como monocitos, macrófagos, eosinófilos, basófilos, además de los linfocitos T y B (Oppenheim 1991; Baggiolini 1994; Miller 1992; Jose 1994; Ponath 1996a) . Ejemplos de éstas son I-309; MCP-1, -2, -3, -4, MIP-1a y –f, RANTES, y eotaxina.

Las quimiocinas actúan a través de receptores que pertenecen a una superfamilia... [Seguir leyendo]

1. Un ácido nucleico L capaz de unirse a MCP-1, en donde el ácido nucleico comprende en la dirección 5’->3’ una primera extensión Caja B1A, una segunda extensión Caja B2 y una tercera extensión Caja B1B, en donde la primera extensión Caja B1A comprende una secuencia de nucleótidos seleccionada del grupo que consiste en ACGCA, CGCA y GCA,

la segunda extensión Caja B2 comprende una secuencia de nucleótidos de CSUCCCUCACCGGUGC-AAGUGAAGCCGYGGCUC, y

la tercera extensión Caja B1B comprende una secuencia de nucleótidos seleccionada del grupo que comprende UGCGU, UGCG y UGC.

2. El ácido nucleico según la reivindicación 1, en donde

la segunda extensión Caja B2 comprende una secuencia de CGUCCCUCACCGGUGCAAGUGAAGCC-GUGGCUC.

3. El ácido nucleico según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 2, en donde a) la primera extensión Caja B1A comprende una secuencia de nucleótidos de ACGCA, y la tercera extensión Caja B1B comprende una secuencia de nucleótidos de UGCGU; o b) la primera extensión Caja B1A comprende una secuencia de nucleótidos de CGCA, y la tercera extensión Caja B1B comprende una secuencia de nucleótidos de UGCG; o c) la primera extensión Caja B1A comprende una secuencia de nucleótidos de GCA, y la tercera extensión Caja B1B comprende una secuencia de nucleótidos de UGC o UGCG.

4. El ácido nucleico según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, en donde la primera extensión Caja B1A comprende una secuencia de nucleótidos de GCA.

5. El ácido nucleico según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4, y preferiblemente según la reivindicación 4, en donde

la tercera extensión Caja B1B comprende una secuencia de nucleótidos de UGCG.

6. El ácido nucleico según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5, en donde el ácido nucleico comprende una secuencia de ácido nucleico según las SEC ID Nº: 37, SEC ID Nº: 116, SEC ID Nº: 117 y SEC ID Nº: 278, o un ácido nucleico homólogo a los mismos, en donde la homología es de al menos un 85%.

7. El ácido nucleico según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 6, en donde el ácido nucleico es capaz de unirse a una quimiocina, en donde la quimicina se selecciona del grupo que comprende eotaxina, MCP-1, MCP-2 y MCP-3.

8. El ácido nucleico según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 7, en donde el ácido nucleico es capaz de unirse a MCP-1 humana.

9. El ácido nucleico según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 8, en donde el ácido nucleico comprende una modificación, en donde la modificación preferiblemente es un resto de elevado peso molecular y/o en donde la modificación preferiblemente permite modificar las características del ácido nucleico según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 8 en términos de tiempo de residencia en el organismo animal o humano, preferiblemente organismo humano.

10. El ácido nucleico según la reivindicación 9, en donde la modificación se selecciona del grupo que consiste en un resto de HES y un resto de PEG.

11. El ácido nucleico según la reivindicación 10, en donde la modificación es un resto de PEG que consiste en un PEG lineal o ramificado, en donde el peso molecular del resto de PEG preferiblemente está entre aproximadamente 20 y 120 kD, más preferiblemente entre aproximadamente 30 y 80 kD y lo más preferiblemente de aproximadamente 40 kD.

12. El ácido nucleico según la reivindicación 10, en donde la modificación es un resto de HES, en donde preferiblemente el peso molecular del resto de HES está entre aproximadamente 10 y 130 kD, más preferiblemente entre aproximadamente 30 y 130 kD y lo más preferiblemente de aproximadamente 100 kD.

13. El ácido nucleico según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 12, en donde la primera extensión Caja B1A y la tercera extensión Caja B1B se hibridan opcionalmente entre sí, en donde con la hibridación se forma una estructura de cadena doble.

14. La molécula de ácido nucleico según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 13 para uso en un método de tratamiento de una enfermedad.

15. La molécula de ácido nucleico según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 13 para uso en un método de diagnosis.

16. Una composición farmacéutica que comprende un ácido nucleico según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 13 y opcionalmente un constituyente adicional, en donde el constituyente adicional se selecciona del grupo que consiste en excipientes farmacéuticamente aceptables, vehículos farmacéuticamente aceptables y agentes farmacéuticamente activos.

17. El uso de un ácido nucleico según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 13 para la fabricación de un medicamento.

18. El uso de un ácido nucleico según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 13 para la fabricación de un medio de diagnóstico.

19. El uso según la reivindicación 17, en donde el medicamento es para el tratamiento y/o la prevención de una enferemedad o trastorno seleccionado del grupo que comprende enfermedades inflamatorias, enfermedades autoinmunes, encefalomielitis autoinmune, accidente cerebrovascular, esclerosis múltiple aguda y crónica, inflamación crónica, artritis reumatoide, enfermedades renales, restenosis, restenosis después de angioplastia, reacciones alérgicas agudas y crónicas, reacciones inmunológicas y alérgicas primarias y secundarias, asma, conjuntivitis, bronquitis, cáncer, aterosclerosis, insuficiencia cardíaca cardiovascular arteriosclerótica o accidente cerebrovascular, psoriasis, artritis psoriática, inflamación del sistema nervioso, dermatitis atópica, colitis, endometriosis, uveítis, trastornos retinianos que incluyen degeneración macular, desprendimiento de retina, retinopatía diabética, retinopatía de premadurez, retinitis pigmentaria, vitreorretinopatía proliferativa y coriorretinopatía serosa central; fibrosis pulmonar idiopática, sarcoidosis, polimiositis, dermatomiositis, anulación de la inmunosupresión, reducción del riesgo de infección, sepsis, inflamación renal, glomerulonefritis, glomerulonefritis progresiva rápida, glomerulonefritis proliferativa, nefropatía diabética, nefropatía obstructiva, necrosis tubular aguda y glomeruloesclerosis difusa, lupus eritematoso sistémico, bronquitis crónica, enfermedad de Behget, esclerosis lateral amiotrófica (ELA) , ateroesclerosis prematura después de la enfermedad de Kawasaki, infarto de miocardio, obesidad, enfermedad hepática crónica, enfermedad de Peyronie, lesión de médula espinal aguda, trasplante de pulmón o riñón, miocarditis, enfermedad de Alzheimer y neuropatía, carcinoma de mama, carcinoma gástrico, cáncer de vejiga, cáncer de ovario, hamartoma, carcinoma colorrectal, adenoma colónico, pancreatitis, enfermedad pulmonar obstructiva crónica (EPOC) y enfermedades intestinales inflamatorias tales como la enfermedad de Crohn

o la colitis ulcerativa.

20. Un complejo que comprende una quimiocina y un ácido nucleico según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 13, en donde la quimiocina se selecciona del grupo que comprende eotaxina, MCP-1, MCP-2 y MCP-3, en donde preferiblemente el complejo es un complejo cristalino.

21. El uso de un ácido nucleico según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 13 para la detección in vitro de una quimiocina, en donde la quimiocina se selecciona del grupo que consiste en eotaxina, MCP-1, MCP-2 y MCP-3.

22. Un método para el escrutinio de un antagonista de quimiocina o de un agonista de quimiocina que comprende los pasos siguientes:

-proporcionar un antagonista de quimiocina candidato y/o un agonista de quimiocina candidato,

-proporcionar un ácido nucleico según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 13,

-proporcionar un sistema de ensayo que provea una señal en presencia de un antagonista de quimiocina y/o de un agonista de quimiocina, y

-determinar si el antagonista de quimiocina candidato es un antagonista de quimiocina y/o si el agonista de quimiocina candidato es un agonista de quimiocina,

en donde la quimiocina se selecciona del grupo que comprende eotaxina, MCP-1, MCP-2 y MCP-3.

23. Un método para el escrutinio de un agonista de quimiocina y/o de un antagonista de quimiocina que comprende las siguientes etapas:

-proporcionar una quimiocina inmovilizada a una fase, preferiblemente una fase sólida,

-proporcionar un ácido nucleico según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 13, preferiblemente un ácido nucleico según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 13 que está marcado,

-añadir un agonista de quimiocina candidato y/o un antagonista de quimiocina candidato, y

-determinar si el agonista de quimiocina candidato es agonista de quimiocina y/o si el antagonista de quimiocina candidato es antagonista de quimiocina,

en donde la quimiocina se selecciona del grupo que comprende eotaxina, MCP-1, MCP-2 y MCP-3.

24. Un kit para la detección de una quimiocina que comprende un ácido nucleico según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 13, en donde la quimiocina se selecciona del grupo que comprende eotaxina, MCP-1, MCP-2 y MCP-3.

25. Un método para la detección del ácido nucleico según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 13 en una muestra, en donde el método comprende las etapas de:

a) proporcionar una muestra que contiene el ácido nucleico según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 13;

b) proporcionar una sonda de captura, donde la sonda de captura es al menos parcialmente complementaria a una primera parte del ácido nucleico según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 13, y una sonda de detección, donde la sonda de detección es al menos parcialmente complementaria a una segunda parte del ácido nucleico según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 13, o, alternativamente, la sonda de captura es al menos parcialmente complementaria a una segunda parte del ácido nucleico según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 13 y la sonda de detección es al menos parcialmente complementaria a la primera parte del ácido nucleico según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 13;

c) dejar que la sonda de captura y la sonda de detección reaccionen bien simultáneamente o bien secuencialmente en cualquier orden con el ácido nucleico según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 13, o con una parte del mismo;

d) opcionalmente detectar si la sonda de captura se hibrida o no con el ácido nucleico según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 13 proporcionado en la etapa a) ; y

e) detectar el complejo formado en la etapa c) que consiste en el ácido nucleico según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 13, y la sonda de captura y la sonda de detección.

26. El método según la reivindicación 25, en donde la sonda de detección comprende un medio de detección, y/o en donde la sonda de captura puede inmovilizarse sobre un soporte, preferiblemente sobre un soporte sólido.

27. El método según la reivindicación 25 ó 26, en donde cualquier sonda de detección que no forme parte del complejo es eliminada de la reacción de tal modo que en la etapa e) solo se detecte una sonda de detección que forme parte del complejo.

28. El método según cualquiera de las reivindicaciones 25 a 27, en donde la etapa e) comprende la etapa de comparar la señal generada por el medio de detección cuando se hibridan la sonda de captura y la sonda de detección en presencia del ácido nucleico según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 13, o de una parte del mismo, y en ausencia de dicho ácido nucleico o parte del mismo.

29. El método según cualquiera de las reivindicaciones 25 a 28, en el que el ácido nucleico que va a ser detectado es el ácido nucleico que tiene una secuencia de ácido nucleico según las SEC ID Nº: 37, 116, 117 ó 278, y la sonda de captura o la sonda de detección comprenden una secuencia de ácido nucleico según la SEC ID Nº: 255 ó la SEC ID Nº: 256.