Una IL-18BP que comprende un primer polipéptido consistente en los aminoácidos 1 a 30,

o en los aminoácidos15 a 30 de la SEC ID NO:1, y un segundo polipéptido consistente en los aminoácidos 31 a 164, o en los aminoácidos31 a 163 de la SEC ID NO:1, en donde el primer y el segundo polipéptidos están unidos por un enlace disulfuro;o un derivado funcional, proteína de fusión o sal de la misma, en donde el derivado funcional comprende al menosun resto unido a uno o múltiples grupos funcionales, que se presentan en forma de una o múltiples cadenas lateralesen los residuos de aminoácidos.

Variantes activas de la proteína que fija IL-18 y usos médicos de las mismas

CAMPO DE LA INVENCIÓN

La presente invención se refiere a nuevas proteínas que fijan la interleuquina 18 (IL-18BPs) . La invención se refiere, adicionalmente, a composiciones farmacéuticas que comprenden estas IL-18BPs, a ácidos nucleicos que codifican tales IL-18BPs, y a usos médicos de dichas IL-18BPs.

Antecedentes de la invención En 1989, se describió un factor sérico inducido por una endotoxina, capaz de inducir el interferón-γ (IFN-γ) obtenido de células del bazo de ratón (Nakamura et al., 1989) . Este factor sérico no funcionaba como inductor directo de IFNγ, sino más bien como co-estimulante junto con IL-2 o mitógenos. Un intento de purificar este factor a partir de suero murino post-endotoxina reveló una proteína de 50-55 kDa aparentemente homogénea. Puesto que otras citoquinas pueden actuar como co-estimulantes de la producción de IFN-γ, la incapacidad para neutralizar anticuerpos contra IL-1, IL-4, IL-5, IL-6 o TNF para neutralizar la actividad sérica indicó que se trataba de un factor diferente. En 1995, los mismos investigadores demostraron que el co-estimulante inducido por endotoxinas para la producción de IFN-γ se hallaba presente en extractos de hígados procedentes de ratones pre-tratados con P. acnes (Okamura et al., 1995) . En este modelo, se expande la población de macrófagos hepáticos (células de Kupffer) y en estos ratones una dosis baja de lipopolisacárido (LPS) bacteriano, que en los ratones no pre-tratados no es letal, se convierte en letal. El factor, denominado factor inductor de IFN-γ (IGIF) y designado, posteriormente, interleuquina-18 (IL-18) , se purificó hasta homogeneidad a partir de 1.200 gramos de hígado de ratones tratados con P. acnes. Se utilizaron oligonucleótidos degenerados, derivados de secuencias de aminoácidos de IL-18 purificada para clonar un ADNc de IL-18 murina. IL-18 es una proteína de 18-19 kDa de 157 aminoácidos, que carece de similitudes evidentes con cualquier péptido en las bases de datos. Se detectan fácilmente ARN mensajeros para IL-18 e interleuquina-12 (IL12) en las células de Kupffer y en macrófagos activados. La IL-18 recombinante induce IFN-gamma de manera más potente que la IL-12, aparentemente a través de una vía diferente (Micallef et al., 1996) . De forma similar a la actividad sérica inducida por endotoxinas, IL-18 no induce INF-γ por sí misma, sino que actúa principalmente como un coestimulante con mitógenos o IL-2. IL-18 potencia la proliferación de células T, aparentemente a través de una vía dependiente de IL-2, y refuerza in vitro la producción de la citoquina Th1, exhibiendo una acción sinérgica cuando se combina con IL-12 en términos de producción reforzada de IFN-γ (Micallef et al., 1996) .

Después de haber clonado la forma murina, en 1996 se dio a conocer la secuencia del ADNc humano para IL-18 (Okamura et al., 1995) .

Por medio de la clonación de IL-18 a partir de tejidos afectados y del estudio de la expresión génica de IL-18, se encontró una estrecha asociación de esta citoquina con una enfermedad autoinmune. El ratón diabético no obeso (NOD) desarrolla espontáneamente insulitis autoinmune y diabetes, que se pueden acelerar y sincronizar por una única inyección de ciclofosfamida. Por PCR de transcriptasa inversa se demostró la presencia de ARNm de IL-18 en el páncreas de ratones NOD durante las etapas precoces de la insulitis. Los niveles de ARNm de IL-18 aumentaron rápidamente después del tratamiento con ciclofosfamida y precedieron a un incremento de ARNm de IFN-γ y, subsiguientemente, diabetes. Es interesante comprobar que estas condiciones cinéticas imitan las del ARNm de IL-12p40, dando como resultado una estrecha correlación de los niveles individuales de ARNm. La clonación del ADNc de IL-18 a partir del ARN pancreático, seguida de una secuenciación, reveló una identidad con la secuencia de IL-18 clonada a partir de las células de Kupffer y macrófagos pre-activados in vivo. Igualmente, los macrófagos de ratones NOD respondieron a la ciclofosfamida con expresión génica de IL-18, en tanto que los macrófagos de ratones Balb/c, tratados en paralelo, no lo hicieron. Por lo tanto, la expresión de IL-18 está regulada de manera anormal en ratones NOD autoinmunes, y se relaciona estrechamente con el desarrollo de diabetes (Rothe et al., 1997) .

La IL-18 juega potencialmente un papel en la inmuno-regulación o en la inflamación al incrementar la actividad funcional del ligando Fas en células Th1 (Conti et al., 1997) . La IL-18 se expresa también en la corteza suprarrenal y, por consiguiente, podría ser un neuro-inmunomodulador secretado, desempeñando un papel importante en la orquestación del sistema inmune tras una experiencia estresante (Chater, 1986) .

In vivo, la IL-18 se forma por escisión de la pro-IL-18 y su actividad endógena parece explicar la producción de IFN-γ en la letalidad de P. acnes y mediada por LPS. La IL-18 madura se produce a partir de su precursor mediante la enzima conversora de IL-1β (enzima conversora de IL-1 beta, ICE, caspasa-1) .

El receptor de IL-18 consiste en al menos dos componentes que cooperan en la fijación del ligando. Se han encontrado sitios de fijación de alta y baja afinidad para IL-18 en células T murinas estimuladas con IL-12 (Yoshimoto et al., 1998) , que indican la existencia de un complejo receptor de múltiples cadenas. Hasta la fecha, se han identificado dos subunidades receptoras, pertenecientes ambas a la familia de receptores de IL-1 (Parnet et al., 1996) . La transducción de señal de IL-18 implica la activación de NF-κB (DiDonato, 1997) .

Recientemente, se ha aislado de la orina humana una proteína soluble que exhibe una gran afinidad por IL-18, y se han descrito los ADNc humano y de ratón (Novick et al., 1999; documento WO 99/09063) . La proteína se ha designado proteína fijadora de IL-18 (IL-18BP) .

IL-18BP no es el dominio extracelular de algunos de los receptores de IL-18 conocidos, sino que se trata de una proteína secretada que circula de forma natural. Pertenece a una nueva familia de proteínas secretadas. La familia incluye, adicionalmente, varias proteínas codificadas por Poxvirus que exhiben una elevada homología con IL-18BP (Novick et al., 1999) . IL-18BP se expresa de forma constitutiva en el bazo, pertenece a la superfamilia de las inmunoglobulinas y presenta una homología limitada con el receptor de IL-1 de tipo II. Su gen está localizado en el cromosoma humano 11q13 y en una secuencia genómica de 8, 3 kb no se ha encontrado ningún exón que codifique un dominio transmembrana (Novick et al., 1999) .

Cuatro isoformas humanas y dos murinas de IL-18BP han sido expresadas y purificadas, resultantes de la escisión y halladas en diversas bibliotecas de ADNc, y se ha evaluado la fijación y neutralización de las actividades biológicas de IL-18 (Kim et al., 2000) . La isoforma a humana de IL-18BP (IL-18BPa) mostró la máxima afinidad por IL-18, con una constante de afinidad rápida y una constante de disociación lenta, y una constante de disociación (K (d) ) de 399 pM. IL-18BPc comparte el dominio Ig de IL-18BPa, excepto los 29 aminoácidos C-terminales; la K (d) ) de IL-18BPc es 10 veces menor (2, 94 nM) . No obstante, las IL-18BPa e IL-18BPc neutralizan la IL-18 >95% hasta un exceso molar de dos. Las isoformas IL-BPb e IL-BPd carecen de un dominio Ig completo, así como de la capacidad para unirse o neutralizar la IL-18. Las isoformas murinas IL-18BPc e IL-18BPd, que poseen un dominio Ig idéntico, neutralizan también >95% de la IL-18 de ratón hasta un exceso molar de dos. Sin embargo, IL-18BPd murina, que comparte un resto C-terminal común con la IL-18BPa humana, también neutraliza la IL-18 humana. La modelización molecular identificó un extenso sitio de fijación mixto, electrostático e hidrófobo, en el dominio Ig de IL-18BP que podría explicar su fijación de alta afinidad al ligando (Kim et al., 2000) .

Se ha descrito un efecto beneficioso de IL-18BP en diversas enfermedades. Ejemplos de tales enfermedades susceptibles de tratamiento con IL-18BP son: metástasis tumorales (documento WO 01/07480) , artritis, enfermedad intestinal inflamatoria y lesión hepática (documento WO 01/62285) , enfermedad cardiaca (documento WO 02/060479) , lesión cerebral traumática (documento WO 02/096456) , sepsis (documento WO 02/092008) , aterosclerosis (documento WO 01/85201) , y trastorno de hipersensibilidad (documento WO 03/033015) .

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1. Una IL-18BP que comprende un primer polipéptido consistente en los aminoácidos 1 a 30, o en los aminoácidos 15 a 30 de la SEC ID NO:1, y un segundo polipéptido consistente en los aminoácidos 31 a 164, o en los aminoácidos 31 a 163 de la SEC ID NO:1, en donde el primer y el segundo polipéptidos están unidos por un enlace disulfuro;

o un derivado funcional, proteína de fusión o sal de la misma, en donde el derivado funcional comprende al menos un resto unido a uno o múltiples grupos funcionales, que se presentan en forma de una o múltiples cadenas laterales en los residuos de aminoácidos.

2. La IL-18BP según la reivindicación 1, en la que la proteína fusionada comprende la fusión con una inmunoglobulina.

3. La IL-18BP según la reivindicación 3, en la que el resto es un resto de polietilenglicol (PEG) .

4. Procedimiento para la producción de una IL-18BP según las reivindicaciones 1 o 2, que comprende la etapa de cultivar una célula hospedadora que comprende un ácido nucleico que codifica una IL-18BP según las reivindicaciones 1 o 2, bajo condiciones apropiadas para la expresión de dicha IL-18BP.

5. Procedimiento para la producción de una IL-18BP según las reivindicaciones 1 o 2, que comprende la etapa de aislar la IL-18BP a partir del sobrenadante del cultivo celular de una célula hospedadora que comprende un ácido nucleico que codifica una IL-18BP, según las reivindicaciones 1 o 2.

6. Composición que comprende una IL-18BP según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3.

7. Uso de IL-18BP según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, para la preparación de un medicamento dirigido al tratamiento y/o la prevención de una enfermedad seleccionada de: metástasis tumoral, psoriasis, artritis, en particular artritis reumatoide, enfermedad intestinal inflamatoria, enfermedad de Crohn, lesión hepática, aterosclerosis, sepsis, infarto de miocardio, lesión cerebral traumática, alergia, enfermedad vascular periférica, esclerosis múltiple.

8. El uso según la reivindicación 7, en donde el medicamento comprende adicionalmente un interferón para uso simultáneo, secuencial o separado.

9. El uso según la reivindicación 8, en el que el interferón es interferón-β.

10. El uso según la reivindicación 7, en el que el medicamento comprende, adicionalmente, un inhibidor del Factor de Necrosis Tumoral (TNF) para uso simultáneo, secuencial o separado.

11. El uso según la reivindicación 10, en el que el inhibidor de TNF es un receptor de TNF soluble.

12. El uso según las reivindicaciones 7 a 11, en donde la IL-18BP se utiliza en una cantidad de aproximadamente 0, 001 a 1000 mg/kg de peso corporal, o aproximadamente 0, 01 a 100 mg/kg de peso corporal, o aproximadamente 0, 1 a 10 mg/kg de peso corporal, o aproximadamente 5 mg/kg de peso corporal.

13. El uso según cualquiera de las reivindicaciones 7 a 12, en donde el medicamento es para administración subcutánea.

14. El uso según cualquiera de las reivindicaciones 7 a 12, en donde el medicamento es para administración intramuscular.

15. Uso de un vector de expresión que comprende un ácido nucleico que codifica una IL-18BP según las reivindicaciones 1 o 2, para la fabricación de un medicamento dirigido al tratamiento y/o a la prevención de una enfermedad seleccionada de: metástasis tumoral, psoriasis, artritis, en particular artritis reumatoide, enfermedad intestinal inflamatoria, enfermedad de Crohn, lesión hepática, aterosclerosis, sepsis, infarto de miocardio, lesión cerebral traumática, alergia, enfermedad vascular periférica, esclerosis múltiple.

16. Uso de una célula modificada genéticamente para producir una IL-18BP según las reivindicaciones 1 o 2, para la fabricación de un medicamento dirigido al tratamiento y/o a la prevención de una enfermedad seleccionada de: metástasis tumoral, psoriasis, artritis, artritis reumatoide, enfermedad intestinal inflamatoria, enfermedad de Crohn, lesión hepática, aterosclerosis, sepsis, infarto de miocardio, lesión cerebral traumática, alergia, enfermedad vascular periférica, esclerosis múltiple.