VACUNAS DE FCV INACTIVADAS MEJORADAS.

[0001] La presente invención se refiere a composiciones inmunogénicas mejoradas inactivadas y estabilizadas contra el calicivirus felino (FCV). La invención también proporciona un procedimiento para la producción de FCV 5 inactivados y estabilizados, y el uso de estos FCV inactivados y estabilizados en la producción de composiciones inmunogénicas FCV. La invención también proporciona las composiciones inmunogénicas según la invención para su uso en procedimientos para inducir respuestas inmunes en los animales de la familia de los félidos, preferentemente gatos. ANTECEDENTES DE LA INVENCIÓN [0002] El calicivirus felino (FCV) se describió por primera vez en 1957 (Fastier, L.B. (1957) Am. J. Vet. Res. 18: 382- 389). El FCV afecta a un gran número de los animales de la familia de los félidos, siendo llevado el FCV por hasta 15 a 20% de los gatos domésticos clínicamente saludables (Coutts et al (1994) Vet. Rec. 135: 555-556; Ellis, T.M. (1981) Australian Vet. J. 57: 115-118; Harbour et al. (1991) Vet. Rec. 128: 77-80; Reubel et al, (1992) feline Dentistry 22: 1347-1360). El calicivirus se da a menudo con otra infección respiratoria superior, tal como el virus del herpes 15 felino (FHV), el virus de la rinotraqueítis, o la clamidiosis en gatos domésticos y félidos salvajes. El FCV se transmite horizontalmente y no hay evidencia de transmisión vertical desde la madre a su gatito durante la gestación (Johnson, R.P. (1984) Res. Vet. Sci. 31: 114-119). La transmisión de FCV ocurre principalmente a través del contacto entre animales infectados y animales saludables o por aerosoles durante el estornudo (Wardley R C. (1976) arco. Virol 52: 243-249). El FCV es bastante resistente a varios agentes desinfectantes y por lo tanto también se puede extender 20 en ausencia de contacto directo. [0003] El FCV es en general conocido por causar enfermedades tales como conjuntivitis, rinitis, traqueítis, neumonía y por vesicularización/ ulceración del epitelio de la cavidad oral. Otros síntomas incluyen fiebre, anorexia, letargia, marcha rígida, y algunas veces secreción nasal y ocular. El FCV suele afectar a la garganta, y a veces a los pulmones; también puede infectar los intestinos y se ha aislado a partir de heces. Después de una fase inicial de 25 hipertermia, estas enfermedades respiratorias suelen venir seguidas por ulceraciones bucales (paladar, lengua, labios, y nariz), rinitis, conjuntivitis, y posiblemente anorexia y astenia. El FCV también puede causar neumonía, enteritis, y dolor articular (síndrome de la cojera). La morbosidad puede ser elevada y a la recuperación le sigue un estado portador prolongado. El tipo de síntomas de la enfermedad causados por el FCV depende de la cepa de FCV; algunas cepas producirán poca enfermedad o ninguna, mientras que otras cepas más virulentas causan 30 pirexia, anorexia, depresión o neumonía. Una cepa particular puede provocar úlceras en las patas así como en la boca. [0004] El calicivirus felino de la Familia Caliciviridae es un virus sin envoltura, que comprende un genoma RNA de sentido positivo de hebra única que es poliadenilado y tiene un tamaño aproximado de 7.7 kilobases (Radford et al. 35 (1997) Proc. 1st Int. Symp. Caliciviruses ESVV 93-99). El cápside de FCV comprende una proteína de cápside mayor única de 66 kDa (kilodalton), la proteína p66. La biología molecular de los calicivirus fue estudiada por Clarke y Lambden (1997) J. Gen. Virol. 8: 291-301. Como muchos virus RNA, hay una gran heterogeneidad en la población vírica de FCV. Las variaciones antigénicas, demostradas a partir de comienzos de los 1970 mediante experimentos de neutralización mediante suero cruzado, permiten clasificar los FCVs en varias cepas víricas o casi-especies 40 (Radford et al. (1997) Proc. 1st Int. Symp. Caliciviruses ESVV 93-99). Se han identificado y aislado varias cepas de FCV, en particular la cepa F9 (depositada en la American Type Culture Collection o ATCC con el número de acceso VR-782), la cepa 2280 (ATCC VR-2057), la cepa KCD (ATCC VR-651), la cepa CFI (ATCC VR-654), la cepa FCV- LLK y la cepa FCV-M8. [0005] Debido al prolongado estado portador después de la recuperación por una infección de FCV, así como a la resistencia del FCV a los agentes desinfectantes, el FCV es muy contagioso y se extiende fácilmente, en particular 45 entre grupos de animales en proximidad cercana, por ejemplo, en refugios de animales o clínicas veterinarias. Por lo tanto, ha habido y sigue habiendo en la técnica una gran necesidad de vacunas eficaces contra el FCV.   [0006] La vacunación contra el FCV fue introducida al final de los 1970s, empleando cepas FCV atenuadas, principalmente la cepa F9 aislada en los USA en 1958 por Bittle (Bittle et al. (1960) Am. J. Vet. Res. 21: 547-550) o cepas derivadas de la F9 por paso in vitro o in vivo ("similares a la F9"). [0007] También hay disponibles vacunas que se basan en cepas FCV inactivadas. Estas vacunas emplean principalmente cepas 255 y 2280, que se aislaron en USA en 1970 en un gato con neumonía (Kahn y Gillepsie, (1970) Cornell Vet. 60: 669-683; Povey et al. (1980) J. Am. Vet. Med. Assoc. 177: 347-350) y en 1983 en un gato 2 aquejado de cojera, respectivamente (Pedersen et al. (1983) Fel. Prac. 13: 26-35; Pedersen N.C. y Hawkins K.F. (1995) Vet Microbiol. 47: 141-156). [0008] Debido a la deriva antigénica a lo largo del tiempo, los antisueros producidos contra cepas de vacuna aisladas en los 1960 y 1970, tales como las cepas F9, 255 o 2280, neutralizan solamente algunas cepas aisladas de 5 las cepas aisladas en los 1990. Por ejemplo, el anti- suero F9 neutraliza el 43% de las cepas aisladas en el período 1990-1996, en contraste con su capacidad para neutralizar el 56% de las cepas aisladas en el período 1980-89 y 86% de las cepas aisladas en el período 1958-79, y sólo 10% de las cepas inglesas aisladas en el período 1990-96 (Lauritzen et al. (1997) Vet. Microbiol. 56: 55-63). Por consiguiente, vacunas atenuadas e inactivadas de viejas cepas de FCV hasta ahora ya no ofrecen suficiente protección contra cepas de FCV recientemente aisladas. 10 [0009] La patente americana No. 6,534,066 describe el uso de nuevas cepas de FCV para la producción de vacunas FCV. Entre estas cepas, la cepa FCV 431 (depositada en la CNMC con el número de acceso I-2166) es un antisuero aislado que se mostró capaz de neutralizar un gran número de cepas aisladas de campo heterólogas. Esto contrasta con las cepas de vacuna históricas, tales como la F9 y la FCV-225, cuyos antisueros neutralizan muy pocas cepas de FCV de campo recientes. 15 [0010] La mayoría de las vacunas comerciales contra la FCV son vacunas atenuadas. Sólo se dispone de unas pocas vacunas inactivadas y todas contienen un adyuvante. Povey y sus colaboradores (Povey et al. (1978) Práctica Felina 8 (3):. 35-42) describen una preparación de formalina inactivada y con adyuvante FCV utilizada en los gatitos. [0011] Cuando se inactiva una vacuna, la inactivación se realiza normalmente mediante un tratamiento químico con agentes como el formol o formaldehido, ß-propiolactona, etilenimina, etilenimina binaria en presencia o ausencia de 20 tratamiento térmico. En la Patente de EE.UU. No. 6.534.066, por ejemplo, se inactiva FCV mediante etilenimina y adyuvada con una emulsión de aceite en agua. La patente de EE.UU. No. 6.355.246 describe vacunas FCV atenuadas aisladas en la orina felina. La inactivación de FCV se puede lograr mediante un tratamiento con formaldehido o etilenimina binaria (BEI). Cabe destacar que la patente de EE.UU. N º 6.355.246 no se refiere a ni proporciona a los expertos en la materia con procedimientos de inactivación de FCV. 25 [0012] Las vacunas inactivadas utilizados hasta ahora contra la FCV requieren o prefieren adyuvantes en la vacuna o una composición inmunogénica para mejorar la respuesta inmune e inducir a una mejor protección contra las cepas heterólogas FCV emergentes en la población de gatos. Sin embargo, las vacunas con adyuvante inducen una mayor tasa de reacciones adversas locales que las vacunas sin adyuvante (Gobar et al, (2002) JAVMA 220 (10):. 1,477-1.482) y por lo tanto aumentan el riesgo de fibrosarcomas asociados a la vacunación en el lugar de inyección (Baker, RJ (1998) Práctica Felina 26 (5): 18-20).   [0013] En la actualidad, las vacunas FCV sin adyuvante son vacunas vivas modificadas, que contienen habitualmente a la cepa F9. La virulencia residual de la FCV F9 ha sido demostrada por varios estudios sobre la calicivirosis post-vacunal (Dawson et al, (1993) Vet Rec 132:... 346-350). Aunque sólo existe un serotipo FCV, se ha observado una alta variación antigénica entre cepas de FCV y se identifican regularmente nuevos aislamientos de 35 campo (Lauritzen, et al (1997) Vet Microbiol 56:... 55-63). Esta alta variación antigénica conduce a menudo a tasas de fracaso cada vez mayores de neutralización FCV... [Seguir leyendo]

1. Composición inmunógena inactivada, estabilizada, sin adyuvante contra el calicivirus felino (FCV), que comprende un FCV inactivado por uno o más agentes de inactivación y estabilizada por un compuesto aldehído, en la cual el compuesto aldehído comprende una cadena alquilo lineal en C1- C5, y en la que la composición inmunogénica es 5 una mezcla con un excipiente o vehículo aceptable y en la que los agentes de inactivación se seleccionan del grupo que consiste en etileneimina, acetiletileneimina, propileneimina, y ß-propiolactona. 2. La composición de la reivindicación 1, en la que el excipiente o vehículo es aceptable desde el punto de vista veterinario. 3. La composición de la reivindicación 1, en la que la composición está liofilizada y es una mezcla con un excipiente o vehículo de liofilización. 4. La composición según cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en la que el agente de inactivación es ßpropiolactona. 5. La composición según cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en la que el agente de inactivación es etileneimina y en la que la etileneimina está presente en una cantidad que va desde aproximadamente 0.5 mM a aproximadamente 20 mM. 6. La composición según cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en la que el agente de inactivación es etileneimina y en la que la etileneimina está presente en una cantidad que va desde aproximadamente 1 mM a aproximadamente 10 mM. 7. La composición de la reivindicación 1, en la cual el compuesto aldehído comprende una cadena alquilo lineal en C1 y en la cual el compuesto aldehído comprende un grupo aldehído. 8. La composición de la reivindicación 1, en la cual el compuesto aldehído comprende una cadena alquilo lineal en C2-C5 y en la cual el compuesto aldehído comprende dos grupos aldehído. 9. La composición de la reivindicación 8, en la que uno de los dos grupos aldehído está reemplazado por una cetona o un grupo epoxi. 25 10. La composición de la reivindicación 1, en la cual el compuesto aldehído se selecciona del grupo que consiste en formaldehido, glicidaldehído, glutaraldehído, glioxal, o metilglioxal. 11. La composición de la reivindicación 10, en la cual el compuesto aldehído es formaldehido y en la que el formaldehido está presente en una cantidad que va desde aproximadamente 0.05 g/l a aproximadamente 0.8 g/l. 12. La composición de la reivindicación 10, en la cual el compuesto aldehído es formaldehido y en la que el formaldehido está presente en una cantidad que va desde aproximadamente 0.1 g/l a aproximadamente 0.5 g/l. 13. La composición de la reivindicación 1, que comprende además un compuesto de neutralización, en la que el compuesto de neutralización comprende tiosulfato y cisteína. 14. La composición de la reivindicación 1, que comprende además al menos una cepa adicional FCV, en la que al menos una o ambas de las cepas FCV está inactivada y estabilizada. 35 15. La composición de la reivindicación 14, en la que la al menos una cepa adicional FCV se selecciona del grupo que consiste en FCV US 100869 (FCV PTA 5930), FCV F9, FCV 255, FCV 2280, FCV 431, FCV G1, FCV LLK, FCV KCD, FCV CFI, y FCV M8. 16. La composición de la reivindicación 1, que comprende además al menos un inmunógeno no-FCV de un patógeno felino. 40 17. La composición de la reivindicación 16, en la que el patógeno felino se selecciona del grupo que consiste en herpesvirus felino (FHV), virus de la leucemia felina (FeLV), virus de la panleucopenia felina (FPV), virus de la peritonitis infecciosa felina (FIPV), virus de la inmunodeficiencia felina (FIV), virus de la rabia, y clamidia felina.   18. La composición de la reivindicación 16, en la que el al menos un inmunógeno no-FCV de un patógeno felino comprende un microorganismo vivo atenuado o un vector recombinante que expresa al menos un inmunógeno de un patógeno felino. 19. Procedimiento de inactivación y estabilización de FCV, que comprende las etapas de reacción del FCV con un agente de inactivación y un compuesto aldehído, en el cual el compuesto aldehído comprende a cadena alquilo 14 lineal en C1- C5, y en la que el agente de inactivación se selecciona del grupo que consiste en etileneimina, acetiletileneimina, propileneimina, y ß-propiolactona, y de recuperación del FCV inactivados y estabilizados. 20. El procedimiento según la reivindicación 19, en la que el agente de inactivación es ß-propiolactona. 21. El procedimiento según la reivindicación 19, en la que el agente de inactivación es etileneimina y en la que la etileneimina está presente en una cantidad que va desde aproximadamente 0.5 mM a aproximadamente 20 mM. 22. El procedimiento según la reivindicación 19, en la que el agente de inactivación es etileneimina y en la que la etileneimina está presente en una cantidad que va desde aproximadamente 1 mM a aproximadamente 10 mM. 23. El procedimiento según la reivindicación 19, en la cual el compuesto aldehído comprende una cadena alquilo lineal en C1 y en la cual el compuesto aldehído comprende un grupo aldehído. 24. El procedimiento según la reivindicación 19, en la cual el compuesto aldehído comprende una cadena alquilo 10 lineal en C2-C5 y en la cual el compuesto aldehído comprende dos grupos aldehído. 25. El procedimiento según la reivindicación 24, en la que uno de los dos grupos aldehído está reemplazado por una cetona o un grupo epoxi. 26. El procedimiento según la reivindicación 19, en la cual el compuesto aldehído se selecciona del grupo que consiste en formaldehido, glicidaldehído, glutaraldehído, glioxal, o metilglioxal. 27. El procedimiento según la reivindicación 26, en la cual el compuesto aldehído es formaldehido y en la que el formaldehido está presente en una cantidad que va desde aproximadamente 0.05 g/l a aproximadamente 0.8 g/l. 28. El procedimiento según la reivindicación 26, en la cual el compuesto aldehído es formaldehido y en la que el formaldehido está presente en una cantidad que va desde aproximadamente 0.1 g/l a aproximadamente 0.5 g/l. 20 29. El procedimiento según la reivindicación 19, que comprende además la etapa de reacción del FCV inactivados y estabilizados con un compuesto de neutralización, en la que el compuesto de neutralización comprende tiosulfato y cisteína. 30. El procedimiento según la reivindicación 19, en la que el FCV inactivados y estabilizados es recuperado por cromatografía de exclusión estérica, ultracentrifugación, y precipitación selectiva. 25 31. El procedimiento según la reivindicación 19, que comprende además la etapa de liofilización del FCV inactivados y estabilizados en un excipiente de liofilización. 32. Un procedimiento para la producción de composición inmunogénica inactivada, sin adjuvante, que comprende la mezcla del FCV inactivados y estabilizados de la reivindicación 1 en una cantidad suficiente para inducir una respuesta inmune contra el FCV con un excipiente o vehículo aceptable desde el punto de vista veterinario. 30 33. Un procedimiento para la producción de una composición inmunogénica inactivada, sin adjuvante para un almacenamiento de larga duración, que comprende la mezcla del FCV inactivados y estabilizados de la reivindicación 1 en una cantidad suficiente para inducir una respuesta inmune contra el FCV con un excipiente de liofilización y congelar la composición.   34. La composición inmunógena inactivada, estabilizada, sin adyuvante de la reivindicación 1 para su uso en la inducción de una respuesta inmune en un félido contra el FCV. 35. La composición inmunógena inactivada, estabilizada, sin adyuvante de la reivindicación 17 para su uso en la inducción de una respuesta inmune en un félido contra el FCV. 36. Combinación que comprende la composición inmunogénica inactivada, estabilizada sin adyuvante de la reivindicación 1 y al menos un inmunógeno no-FCV de otro patógeno felino para su uso en la inducción de una respuesta inmune en un félido contra el FCV y al menos un inmunógeno no- FCV de un patógeno felino. 37. La combinación según la reivindicación 36, en la que el al menos un patógeno felino adicional se selecciona del grupo que consiste en el herpesvirus felino (FHV), el virus de la leucemia felina (FeLV), el virus de la panleucopenia felina (FPV), el virus de la peritonitis infecciosa felina (FIPV), el virus de la inmunodeficiencia felina (FIV), el virus de la rabia, y la clamidia felina 45 38. La combinación según la reivindicación 36, en la que el al menos un inmunógeno no-FCV de un patógeno felino comprende un microorganismo vivo atenuado o un vector recombinante que expresa al menos un inmunógeno de un patógeno felino.   Promedios de las puntuaciones clínicas totales por tipo de de vacunas Fracción de p66 vírica Fracc. de p66 soluble Puntuación clínica total 16 Emulsión PBS Tipo de formulación   Promedios de las puntuaciones clínicas máximas por tipo de de vacunas Fracción de p66 vírica Fracc. de p66 soluble Puntuación clínica máxima 17 Emulsión PBS Tipo de formulación   Promedios de los títulos de anticuerpos neutralizantes anti-FCV255 por grupo y día Grupo A Grupo B Grupo C Pormedio de titulación de anticuerpo neutralizante (log10) 18 D70 D28 D56 Días D0   Puntuaciones globales por grupos Temperatura rectal Pérdida de peso Síntomas clínicos Puntuaciones globales 19 Grupo C Grupo B Grupo A   Promedio de excreción FVC (log10 CCID50/ml) tras la provocación por grupo y día Grupo A Grupo B Grupo C Título de FCV CCID 50/ml (log10) D70 D67 D64 D62 D60 D58 D56 Días