Uso del gen NcSRS9 y la proteína NcSRS9 para la prevención y el diagnóstico de la neosporosis.

La presente invención se refiere a la molécula polinucleotídica correspondiente al gen NcSRS9 de Neospora caninum y el antígeno que codifica, NcSRS9, proteína expresada durante el estadio de bradizoíto; así mismo, se refiere a los cebadores, los vectores recombinantes, las células hospedadoras transformadas o transfectadas y las proteínas expresadas de forma recombinante que derivan de dicho gen, así como al uso de estos productos y los anticuerpos específicos producidos frente a ellos como reactivos para técnicas de detección directa del parásito, a partir de muestras de los animales infectados, y para la producción de vacunas frente a la enfermedad.

USO DEL GEN NcSRS9 Y LA PROTEÍNA NcSRS9 PARA LA PREVENCIÓN Y EL DIAGNÓSTICO DE LA NEOSPOROSIS

RESUMEN

Uso del gen NcSRS9 y la proteína NcSRS9 para la prevención y el diagnóstico de la neosporosis. La presente invención se refiere a la molécula polinucleotídica correspondiente al gen NcSRS9 de Neospora caninum y el antígeno que codifica, NcSRS9, proteína expresada durante el estadio de bradizoíto; así mismo, se refiere a los cebadores, los vectores recombinantes, las células hospedadoras transformadas o transfectadas y las proteínas expresadas de forma recombinante que derivan de dicho gen, así como al uso de estos productos y los anticuerpos específicos producidos frente a ellos como reactivos para técnicas de detección directa del parásito, a partir de muestras de los animales infectados, y para la producción de vacunas frente a la enfermedad.

OBJETO DE LA INVENCIÓN La presente invención se establece en el campo de la sanidad animal y se refiere, según se expresa en el enunciado de esta memoria descriptiva, a la prevención y el diagnóstico de la enfermedad producida por el protozoo parásito Neospora caninum. De forma más concreta, la invención se relaciona con la molécula polinucleotídica correspondiente al gen NcSRS9 de N caninum y el antígeno que codifica, NcSRS9, proteína expresada durante el estadio de bradizoíto, así como los oligonucleótidos, los vectores recombinantes, las células hospedadoras transformadas y las proteínas expresadas de forma recombinante, así como el uso de estos reactivos para técnicas de detección directa del parásito en los animales infectados y para la producción de vacunas frente a la enfermedad.

ANTECEDENTES

La neosporosis

Neospora caninum es un parásito protozoo perteneciente al phylum Apicomplexa que incluye otros parásitos patógenos importantes como Toxoplasma gondii. N caninum está descrito desde 1989 como agente productor de aborto y mortalidad neonatal en el ganado bovino (Thilsted and Dubey, 1989. J. Vet. Diagn. Invest. 1, 205-209) , aunque también es capaz de infectar a un amplio espectro de especies de mamíferos (Dubey, 2003. Korean J. Parasitol. 41, 1-16; Gondim et al., 2004. J. Parasitol. 90, 1361-1365; Moore, 2005. Vet. Parasitol. 127, 87-97) .

La neosporoslS bovina está considerada como una enfermedad parasitaria de distribución cosmopolita y una de las causas más frecuentes de fallo reproductivo (Dubey et al., 2007. Clin. Microbio. Rev. 20, 323-367) . La manifestación clínica más importante de la infección en las hembras gestantes es el aborto, que puede ocurrir entre el tercer y noveno mes de gestación, siendo más frecuente en tomo a los 5-6 meses. Los temeros congénitamente infectados que nacen vivos pueden presentar problemas neuromusculares, aunque lo más frecuente es el nacimiento de temeros infectados pero clínicamente sanos (Buxton et al., 2002. Trends Parasitol. 18, 546552) . Asimismo, la neosporosis puede afectar a los perros, hospedadores definitivos, aunque pueden actuar también como hospedadores intermediarios, ocasionando polimiositis, encefalitis, parálisis e inclusive la muerte (Lindsay and Dubey, 1989. 1. Parasitol. 75, 163-165; Buxton et al., 2002. Trends Parasitol. 18, 546-552) .

N caninum presenta un ciclo de vida que comprende tres estadios infectantes (Dubey and Lindsay, 1996. Vet. Parasitol. 67, 1-59; Basso et al., 2001. J. Parasitol. 87, 612618) . Los esporozoítos infectan al hospedador intermediario por ingestión de los ooquistes eliminados en las heces del hospedador definitivo y que esporulan en el medio ambiente. En el hospedador intermediario se desarrollan dos fases intracelulares distintas: los taquizoítos, de replicación rápida y responsables de la fase aguda de la infección, y los bradizoítos, la forma de multiplicación lenta del parásito, que se acantonan dentro de los quistes tisulares localizados fundamentalmente en el sistema nervioso central y que son responsables de la fase crónica de la infección. Estos bradizoítos permanecen latentes en los quistes hasta su reactivación y conversión a taquizoítos pudiendo desencadenar la recrudescencia de la enfermedad (Antony and Williamson, 2001. New Zeal. Vet. J. 49, 42-47; Buxton et al., 2002. Trends Parasitol. 18, 546-552) .

Diversos estudios en N caninum indican que la diferenciación de taquizoíto a bradizoíto en estos parásitos es un fenómeno inducido por estrés, aunque no se conocen con exactitud los mecanismos moleculares que determinan el paso de una fase del ciclo a otra (Risco-Castillo et al., 2004. J. Parasitol. 32, 1253-1265; Eastick and Elsheikha, 2010. Parasitol. Res. 106, 1009-1014) . Asimismo, se ha sugerido una implicación de la respuesta inmune del hospedador en la latencia y la reactivación de la infección en animales infectados de forma crónica (Hemphill and Gottstein, 2006. Acta Parasitologica. 51, 15-25; Eastick and Elsheikha, 2010. Parasitol. Res. 106, 1009-1014) .

Antígenos de N. caninum

En lo que se refiere a la comparación de la composición antigénica entre el taquizoíto y el bradizoíto de N caninum, la información disponible hasta el momento es escasa.

En N caninum se han identificado antígenos específicos del taquizoíto o compartidos por ambos estadios (Fuchs et al., 1998. J. Parasitol. 84, 753-758; Lee et al., 2004. J. Vet. Sci. 5, 139-145; Shin et al., 2004. Proteomics 4, 3600-3609; Shin el al., 2005. Vet. Parasitol. 134, 41-52; Kang el al., 2008. Parasitol. Res. 103, 1011-1018) . Entre estos antígenos se han descrito dos proteínas de superficie: NcSAG 1 (Hemphill el al., 1997. Parasitology 115, 371-380) , específica de taquizoíto, cuyo gen fue clonado por Howe el al. (1998. Infect. Immun. 66, 5322-5328) , Y NcSRS2 (Hemphill el al., 1996. Parasitol. Res. 82, 497-504) , que se expresa de forma conjunta en los taquizoítos y en los bradizoítos.

También se han identificado seis proteínas de micronemas, NcMIC3 (Sonda el al., 2000. Mol. Biochem. Parasitol. 108, 39-51) , NcMIC 1 (Keller el al., 2002. Infect.

lmmun. 70, 3187-3198) , presentes en ambos estadios, y NcMIC2 (Lovett et al., 2000. Mol. Biochem. Parasitol. 107, 33-43) , NcMIC4 (Keller et al., 2004. lnfect. lmmun. 72, 4791-4800) , NcMICI0 (Atkinson et al., 2001. lnt. J. Parasitol. 31, 67-71) , así como NcAMAl (Zhang et al., 2007. Mol. Biochem. Parasito. 151, 205-212) identificadas a partir de taquizoítos. Asimismo, se ha incluido en el banco de genes una secuencia de N caninum denominada NcMICll (AF539703) , que podría codificar una proteína de micronemas ya que su secuencia presenta una homología elevada con la secuencia que codifica la proteína de T gondii TgMICl1.

Respecto a proteínas de roptrias, hasta el momento tan sólo se ha identificado y clonado la proteína NcROP2, implicada en el proceso de invasión celular por los taquizoítos (Debache et al., 2008. lnt. J. Parasito. 38, 1455-1463) .

Otros genes que han sido clonados son NcGRA6 y NcGRA7, que codifican proteínas de gránulos densos del taquizoíto de N caninum (Lally et al., 1996. Clin. Diagn. Lab. lmmunol. 3, 275-279) y las denominadas NcGRA2 (Ellis et al., 2000. Parasitology 120 (Pt 4) , 383-390) y NcGRAl (Lee et al., 2003. Proteomics 3, 2339-2350) . Las proteínas NcGRAl, NcGRA2, y NcGRA7 se localizan no sólo en el estadio de taquizoíto sino también en la pared de los quistes producidos in vitro (Vonlaufen et al., 2004.72, 576-83) .

Con base en varios de estos antígenos se han desarrollado diversos ELISAs recombinantes para el diagnóstico de la infección por N caninum y se ha probado la utilidad de diversas vacunas de subunidades basadas en algunas de estas proteínas en modelos murinos de infección (revisado en: Dubey and Schares et al., 2006. Vet. Parasitol. 140, 1-34; Ellis et al., 2009. lnt. J. Parasitol. 39, 1173-1187) .

Finalmente, se han clonado genes que expresan enzimas en N caninum: el gen que codifica para la NcNTPasa-l, localizada en los gránulos densos (Asai et al., 1998. Exp. Parasitol. 90, 277-285) ; NcSUBl, que expresa una serin-proteasa de 65 kDa localizada en los micronemas del taquizoíto (Louie and Conrad, 1999. Mol. Biochem. Parasitol. 103, 211-223; Louie et al., 2002. 1. Parasitol. 88, 1113-1119) ; un gen que codifica una superóxido dismutasa (Fe-SOD) que se expresa tanto en el estadio de taquizoíto como en el de bradizoíto (Cho et al., 2004. J. Parasitol. 90, 278-85) Y el gen que codifica una di sulfuro isomerasa (NcPDI) específica del taquizoíto e implicada en la interacción del parásito con la célula hospedadora... [Seguir leyendo]

1. Molécula polinucleotídica caracterizada por SEQ ID NO: 13 que consiste en el gen NcSRS9 de Neospora caninum y codifica la proteína NcSRS9 de Neospora caninum caracterizada por SEQ ID NO: 15.

2. Molécula polinucleotídica caracterizada por SEQ ID NO: 14 que comprende la secuencia polinucletídica definida en la reivindicación 1.

3. Molécula polinucleotídica con al menos un 95% de identidad con las moléculas polinucleótídicas definidas en las reivindicaciones 1 ó 2.

4. Método para detectar N caninum a partir de tejidos animales mediante PCR o RTPCR o mediante sondas de ADN que incluye cualquiera de los oligonucleótidos F3.2BSR4, F4.2BSR4, SECF1, SECF2, F5BSR4, F6BSR4, F7BSR4, F8BSR4, NcSRS9F, NcSRS9R2, FoSRS9KpnI y ReSRS9SacI, caracterizados por SEQ ID NO: 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11 Y 12, como cebadores o como sondas.

5. Vector recombinante que comprende una secuencia nucleotídica definida en las reivindicaciones 1, 2 ó 3.

6. Células eucariotas hospedadoras transfectadas con los vectores recombinantes de la reivindicación 5.

7. Células procariotas hospedadoras transformadas con los vectores recombinantes de la reivindicación 5.

8. Polipéptido sustancialmente purificado o aislado seleccionado de (a) la proteína antigénica NcSRS9 de N caninum, caracterizada por SEQ ID NO:15; (b) polipéptidos derivados o formas truncadas con al menos un 90% de identidad con la proteína NcSRS9 (SEQ ID NO: 15) y que conservan sus características antigénicas; o (c)

proteínas recombinantes que incluyen NcSRS9 (SEQ ID NO: 15) o incluyen polipéptidos derivados de NcSRS9 y que conservan sus características antigénicas.

9. Polipéptido según la reivindicación 8 que incluye desde el aminoácido 40 al aminoácido 375 de SEQ ID NO: 15.

10. Método para producir un polipéptido que comprende el cultivo de las células hospedadoras de las reivindicaciones 6 ó 7 en condiciones que permiten la expresión de un polipéptido definido en cualquiera de las reivindicaciones 8 ó 9.

11. Anticuerpos monoclonales o policlonales específicos frente a los polipéptidos definidos en las reivindicaciones 8 y 9.

12. Método para la detección de N caninum a partir de tejidos animales mediante inmunohistoquímica o inmunofluorescencia o cualquier otra técnica basada en la detección directa del parásito mediante anticuerpos que incluye anticuerpos monoclonales o policlonales específicos definidos en la reivindicación 11.

13. Composición inmunogénica o formulación vacunal que comprende: (a) un polipéptido definido en las reivindicaciones 8 y 9; (b) una molécula polinucleotídica según las reivindicaciones 1-3; (c) un vector recombinante como el definido en la reivindicación 5; (d) las células hospedadoras transfectadas según reivindicación 6; o

(e) las células hospedadoras transformadas según reivindicación 7.

14. Composición inmunogénica o formulación vacunal según la reivindicación 13, que comprende un adyuvante, una o varias cito quinas o partículas no infecciosas similares a las cápsides víricas (VLP) .

15. Kit de vacunación para mamíferos contra la neosporosis que comprende un contenedor que incluye una composición inmunogénica o formulación vacunal según cualquiera de las reivindicaciones 13 ó 14.