La presente invención se refiere al gen NsSAG4, su RNA mensajero,

los oligocluneótidos diseñados en función de su secuencia nucleotídica, o cualquiera de sus fragmentos, así como la proteina NcSAG4 que codifia, o cualquiera de sus formas recombinantes, los vectores de expresión, así como las células hospedodoras que los contengan, para el diagnóstico y la vacunación para la prevención de la neosporosis, así como su uso como marcador específico de la fase de bradizoíto de N. caninum, para el análisis de la patogenia o de la eficacia de las vacunas frente al establecimiento de la infección crónica en el hospedador intermediario.

Uso del gen NcSAG4 para el diagnóstico y prevención de la neosporosis, y como marcador para el análisis de la patogenia.

Objeto de la invención

La presente invención se establece en el campo de la sanidad animal y se refiere, según se expresa en el enunciado de esta memoria descriptiva, al diagnóstico, análisis de la patogenia y la prevención de la enfermedad producida por el parásito protozoo Neospora caninum. De forma más concreta la invención se refiere a la molécula polinucleotídica correspondiente al gen NcSAG4 de N. caninum, su ARN mensajero y el antígeno que codifica, NcSAG4, siendo éste una proteína específica del estadio de bradizoíto, así como a los oligonucleótidos, los vectores recombinantes, las células hospedadoras transformadas, y las proteínas expresadas de forma recombinante, al uso de éstos como reactivos para el diagnóstico de la enfermedad, su aplicación al desarrollo de técnicas moleculares que permitan estudiar la patogenia de la enfermedad, además de a su utilidad para la producción de vacunas.

Antecedentes

La neosporosis

N. caninum es un parásito protozoo perteneciente al phylum Apicomplexa que incluye otros parásitos patógenos importantes como Toxoplasma gondii con el que guarda mucha relación. N. caninum está descrito desde 1989 como agente productor de aborto y mortalidad neonatal en el ganado bovino (Thilsted and Dubey. 1989. J. Vet. Diagn. Invest. 1, 205-209) , aunque es capaz de infectar a un amplio espectro de especies de mamíferos (Buxton et al. 2002. Trends Parasitol. 18, 546-552) .

La neosporosis bovina está considerada como una enfermedad parasitaria de distribución cosmopolita y una de las causas más frecuentes de fallo reproductivo en los diversos países donde se ha estudiado (Trees et al. 1999. Int. J. Parasitol. 29, 1195-1200; Anderson et al. 2000, Anim. Reprod. Sci. 60-61, 417-431) , incluido España (González et al. 1999. Vet. Rec. 144, 145-150; Pereira-Bueno et al. 2003. Vet. Parasitol. 111, 143-152) . La manifestación clínica más importante de la infección en las hembras gestantes es el aborto y generalmente tiene lugar entre el tercer y noveno mes de gestación, siendo más frecuente en torno a los 5-6 meses. Los terneros afectados que nacen vivos pueden presentar problemas neuromusculares, apareciendo los primeros signos clínicos a los 4-5 días post-parto, aunque estos se pueden retrasar hasta dos semanas. Sin embargo, lo más frecuente es el nacimiento de terneros clínicamente sanos, pero crónicamente infectados (Dubey and Lindsay. 1996. Vet. Parasitol. 67, 1-59) . Asimismo la neosporosis puede afectar a los perros, su hospedador definitivo, donde produce polimiositis, encefalitis, parálisis y puede causar la muerte (Lindsay and Dubey. 1989. J. Parasitol. 75, 163-165; Buxton et al. 2002. Trends Parasitol. 18, 546-552) .

Como T. gondii, N. caninum tiene un ciclo de vida que comprende tres estadios. Los esporozoítos, que infectan al hospedador intermediario por ingestión de los ooquistes eliminados por el hospedador definitivo. Por otro lado, los taquizoítos, la forma de replicación rápida, responsables de las fase aguda de la infección, cuya misión es la diseminación a través de los tejidos del hospedador. Este proceso finaliza cuando el hospedador desarrolla inmunidad y se establece entonces una fase crónica, con una multiplicación lenta del parásito, formándose quistes tisulares con bradizoítos en su interior, los cuales se han observado tanto en el tejido nervioso de diversas especies con infecciones naturales y experimentales (Dubey et al., 1988, J. Am. Vet. Med. Assoc. 193, 1259-1263; Dubey et al. 1990. J. Am. Vet. Med. Assoc. 197: 1043-1044; Barr et al. 1992. J. Vet. Diagn. Invest. 4, 365-367; Kobayashi et al. 2001. J. Parasitol. 87: 434-436) , como en el tejido muscular esquelético del perro y de la vaca con infecciones naturales (Peters et al. 2001. Int. J. Parasitol. 31, 1144-1148) . Estos bradizoítos permanecen latentes en los quistes de los tejidos hasta su reactivación (Antony and Williamson. 2001. New Zeal. Vet. J. 49, 42-47; Buxton et al. 2002. Trends Parasitol. 18, 546-552) . Hoy en día no se conocen los mecanismos que determinan el paso de taquizoíto a bradizoíto y viceversa en los parásitos del grupo Apicomplexa como T. gondii o N. caninum, pero se ha sugerido que la respuesta inmune puede estar influyendo en la latencia y la reactivación de la infección en animales infectados de forma crónica (Lyons et al., 2002, Trends Parasitol. 18, 198-201) .

En relación con la transmisión de la enfermedad, los estudios más recientes indican la importancia relativamente escasa de la transmisión postnatal y la persistencia, durante toda la vida, de la infección congénita (Davison et al. 1999. Int. J. Parasitol. 29, 1683-1689; Hietala and Thurmond. 1999. Int. J. Parasitol. 29, 1669-1676) . La transmisión congénita tiene un papel prominente con porcentajes que oscilan entre el 50% y el 95% (Wouda et al. 1998. Theriogenology 49, 1311-1316; Pereira-Bueno et al. 2000. in: Hemphill and Gottstein (Eds.) Int. J. Parasitol. 30, 906909) y parece jugar un papel relevante en la propagación y mantenimiento de la enfermedad (Björkman et al. 1996.

J. Am. Vet. Med. Assoc. 208, 1441-1444; Paré et al. 1996. Can. J. Vet. Res. 60, 133-139; Anderson et al. 1997. J. Am. Vet. Med. Assoc. 210, 1169-1172; Schares et al. 1998. Vet. Parasitol. 80, 87-98) .

Antígenos de N. caninum

En lo que se refiere a la comparación de la composición antigénica entre el taquizoíto y el bradizoíto de N. caninum, la información disponible hasta el momento es escasa, ya que tan solo se ha realizado un estudio en el que se identificaron antígenos específicos del taquizoíto o compartidos por ambos estadios (Fuchs et al. 1998. J. Parasitol. 84, 753-758) , hecho que contrasta con los estudios realizados en T. gondii, donde son varios los antígenos específicos de estadio identificados y caracterizados. Entre los antígenos de N. caninum, se han descrito dos proteínas de superficie, NcSAG1 (Hemphill et al. 1997. Parasitology, 115, 371-380) , específica de taquizoíto, cuyo gen fue clonado por Howe et al. (1998. Infect. Immun., 66, 5322-5328) y NcSRS2 (Hemphill et al. 1996. Parasitol. Res. 82, 497-504) , que se expresa de forma conjunta en los taquizoítos y en los bradizoítos. Estas dos proteínas de superficie de N. caninum han sido ensayadas recientemente como vacunas de subunidades en un modelo murino (Cannas et al. 2003a. Parasitology 126 (Pt. 4) , 303-312) . Recientemente, se han identificado dos proteínas de micronemas, NcMIC3 (Sonda et al. 2000. Mol. Biochem. Parasitol. 108, 39-51) y NcMIC1 (Keller et al. 2002. Infect. Immun. 70, 3187-3198) , que se expresan en ambos estadios del parásito. Asimismo, se han incluido en el banco de genes dos secuencias de Neospora denominadas NcMIC10 y NcMIC11, que podrían codificar dos proteínas de micronemas, ya que sus secuencias presentan una homología elevada con las secuencias que codifican las proteínas de T. gondii TgMIC10 y TgMIC11, respectivamente. Otros genes que han sido clonados son NcGRA6 y NcGRA7, que codifican proteínas de gránulos densos del taquizoíto de N. caninum, en base a las cuales se ha desarrollado un ELISA para el diagnóstico de la enfermedad (Lally et al.1996. Clin. Diagn. Lab. Immunol. 3, 275279) . Además de estas proteínas, otras de gránulos densos de 29 y 67 kDa, denominadas NcNTPasa-I (Asai et al. 1998. Exp. Parasitol. 90, 277-285) y NcGRA2 (Ellis et al. 2000. Parasitology 120 (Pt 4) , 383-390) , respectivamente, han sido identificadas y caracterizadas. Por otro lado, la proteína NcMIC3, localizada en los micronemas de taquizoítos intracelulares (Naguleswaran et al. 2001. Infect. Immun. 69, 6483-6494) , cuyo gen ha sido clonado, ha sido expresada como proteína recombinante para ser utilizada con fines vacunales (Cannas et al. 2003b. J. Parasitol. 89 (Pt.1) 44-50) .

Finalmente, NcSUB1 es el único gen clonado de N. caninum, que expresa un enzima. NcSUB1 es una serinproteasa de 65 kDa (Louie and Conrad. 1999. Mol. Biochem. Parasitol. 103, 211-223; Louie et al. 2002. J. Parasitol. 88, 1113-1119) , localizada en los micronemas del taquizoíto, la cual presenta una elevada identidad aminoacídica con la proteína de T. gondii denominada TgSUB1.

En relación a los antígenos específicos del bradizoíto de Neospora no se ha identificado ninguno hasta el momento, debido a la dificultad de obtener quistes con bradizoítos tanto in vitro como in vivo. Sin embargo en T.gondii sí se han descrito antígenos específicos de bradizoíto entre los cuales se ha descrito... [Seguir leyendo]

1. Molécula polinucleotídica de 601 nucleótidos aislada de Neospora caninum y caracterizada por la SEC ID Nº: 9, correspondiente al gen NcSAG4, que comprende una ORF de 522 nucleótidos que codifica la proteína antigénica NcSAG4 de 173 aminoácidos y caracterizada por la SEC ID Nº:10

2. Molécula polinucleotídica seleccionada del grupo de secuencias constituido por el gen NcSAG4 de Neospora caninum, caracterizado por la SEC ID Nº: 9 y por fragmentos de NcSAG4 (SEC ID Nº: 9) que codifican los polipéptidos que conservan las características antigénicas de NcSAG4.

3. El uso de los oligonucleótidos: SAG4-2, SAG4-3, SAG4-4, 1R5SAG4, 2R5SAG4, 1F3SAG4 y 2F3SAG4, FNcSAG4, ReNcSAG4, F85NcSAG4, Re444NcSAG4 caracterizados por las SEC ID Nº: 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 11,

12, 13 y 14, para la detección de N. caninum por PCR o RT-PCR, para su uso como sondas de ADN, o para la amplificación por PCR de cualquier fragmento de la secuencia descrita en la reivindicación 1.

4. Un vector recombinante que comprenda la secuencia nucleotídica caracterizada por la SEC ID Nº: 9 según las reivindicaciones 1 a 2.

5. Las células eucariotas hospedadoras transfectadas con los vectores recombinantes de la reivindicación 4.

6. Las células procariotas hospedadoras transformadas con los vectores recombinantes de la reivindicación 4.

7. Un polipéptido sustancialmente purificado o aislado seleccionado de (a) la proteína antigénica NcSAG4 de N. caninum, caracterizada por la SEC ID Nº:10 según la reivindicación 1; (b) secuencias modificadas química o enzimáticamente derivadas de la proteína NcSAG4 (SEC ID Nº: 10) que conservan sus características antigénicas; (c) polipéptidos derivados de NcSAG4 (SEC ID Nº: 10) que conservan sus características

antigénicas; (d) proteínas recombinantes que incluyen NcSAG4 (SEC ID Nº: 10) o incluyen polipéptidos derivados de NcSAG4 (SEC ID Nº: 10) que conservan sus características antigénicas.

8. Uso de las moléculas polinucleotídicas descritas en las reivindicaciones 1 a 2 para el diagnóstico de la infección crónica por N. caninum a partir de tejidos o fluidos de los animales mediante PCR o RT-PCR, hibridación in situ con sondas de ADN o cualquier otro procedimiento de detección basado en los ácidos nucleicos del parásito.

9. Uso de los polipéptidos descritos en la reivindicación 7 para el diagnóstico de la infección crónica por N. caninum mediante enzimoinmunoanálisis (ELISA) , radioinmunoanálisis (RIA) , inmunotransferencia o cualquier otro procedimiento basado en la capacidad antigénica de dichos polipéptidos.

10. Uso de anticuerpos monoclonales o suero policlonal específico frente a los polipéptidos descritos en la reivindicación 7, para el diagnóstico de la infección crónica por N. caninum mediante un ELISA de competición.

11. Uso de anticuerpos monoclonales o suero policlonal específico frente a los polipéptidos descritos en la reivindicación 7, para el diagnóstico de la infección crónica por N. caninum en los tejidos de los animales mediante inmunohistoquímica, inmunofluorescencia o cualquier otro procedimiento basado en la detección del parásito por el citado suero.

12. Una composición inmunogénica que comprenda: (a) un polipéptido descrito en la reivindicación 7; (b) una

molécula polinucleotídica según las reivindicaciones 1 a 2; (c) un vector recombinante como el descrito en la reivindicación 4; (d) células hospedadoras transfectadas según la reivindicación 5; o (e) células hospedadoras transformadas según la reivindicación 6, contra la neosporosis.

13. Una composición inmunogénica según la reivindicación 12, que comprenda un adyuvante o una o varias citocinas.

14. Un procedimiento de preparación de una composición inmunogénica que comprenda la formulación de al menos una de las siguientes: (a) un polipéptido según la reivindicación 7; (b) una molécula polinucleotídica que contenga una secuencia que codifique el polipéptido de la reivindicación 7; (c) un vector recombinante como los descritos en la reivindicación 4; (d) células hospedadoras transfectadas según la reivindicación 5; (e) células hospedadoras transformadas según la reivindicación 6, contra la neosporosis.

Figura 1

1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12

Reasociación ºC 43 43 45 43 45 48 50 53 56 L 45 56

C-Cel Nc ME-49

3)

GW5’

GW3’

Figura 3

Panel A

Panel B

Panel C

T7-TAG

L 1Kb L 100 pb

Figura 5

1 2 3 4 5 PM*

pRNcSAG4

kDa

97, 4 66, 2

21, 5 14, 4

Figura 6

PANEL A 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10

pRNcSAG4

PANEL B

Figura 7

1 2 34

p.b.

ARNm NcSAG4

100 80