USO DE TREHALOSA-6-FOSFATO SINTASA PARA MODULAR EL CRECIMIENTO VEGETAL.

El uso de la inactivación de una trehalosa-6-fosfato sintasa de clase II vegetal para promover el crecimiento vegetal.

Uso de trehalosa-6-fosfato sintasa para modular el crecimiento vegetal La presente invención se refiere al uso de la inactivación de una trehalosa-6-fosfato sintasa vegetal de clase II para promover el crecimiento vegetal. Más específicamente, se refiere al uso de la inactivación de la trehalosa-6-fosfato sintasa de clase II, que comprende tanto una parte similar a sintasa como una parte similar a fosfatasa, para promover el crecimiento vegetal. Preferiblemente, la actividad de la trehalosa-6-fosfato sintasa de clase II se disminuye para obtener una mayor producción de biomasa vegetal. La trehalosa es un disacárido muy extendido, que aparece en bacterias, hongos, insectos y plantas. En microbios, la acumulación de trehalosa está asociada generalmente con resistencia a estrés, no al menos con resistencia a estrés osmótico y de desecación. En plantas, sin embargo, excepto para algunas plantas de la resurrección tales como Selaginella lepidophylla, el papel de la trehalosa es menos claro.

En la mayoría de los casos, la síntesis de trehalosa es un proceso de dos etapas en el que la trehalosa-6-fosfato sintasa (TPS) sintetiza trehalosa-6-fosfato (T6P) , seguido de una desfosforilación hasta trehalosa mediante T6P fosfatasa (TPP) . Aunque en la mayoría de las plantas la trehalosa es muy poco detectable, están presentes múltiples homólogos tanto del gen de TPS como de TPP, por ejemplo en Arabidopsis (Vogel et al., 2001; Leyman et al., 2001; Eastmond et al., 2003) . La acumulación de trehalosa obtenida en plantas transgénicas, transformadas con genes heterólogos de la biosíntesis de trehalosa, conduce a una tolerancia mejorada a estrés abiótico (Garg et al., 2002; Jang et al., 2003) . Sin embargo, la ausencia de acumulación significativa de trehalosa en la mayoría de las plantas, a pesar de la presencia de múltiples genes de la biosíntesis de trehalosa, prueba el papel regulador de los productos génicos en lugar del papel de la trehalosa como protector contra el estrés. De hecho, varios autores sugieren un papel regulador para TPS (Avonce et al 2004) y su producto génico T6P en el metabolismo del azúcar (Eastmond et al., 2003) y la síntesis del almidón (Kolbe et al., 2005) . T6P es indispensable para la utilización de hidratos de carbono y el crecimiento (Schluepmann et al., 2003) , pero la acumulación de T6P parece provocar una inhibición del crecimiento en plántulas (Schluepmann et al., 2004) . Los actuales datos son algunas veces contradictorios, y el papel de los genes de la biosíntesis de trehalosa todavía está lejos de estar claro. Ninguna de estas publicaciones relaciona un posible papel de TPS de las plantas, en particular TPS vegetal de clase II, con el crecimiento y producción vegetales.

El documento EP0901527 describe la regulación del metabolismo vegetal modificando el nivel de T6P. Más específicamente, se reivindica un incremento en la producción de plantas incrementando la disponibilidad intracelular de trehalosa-6-fosfato. Sin embargo, bastante contradictoriamente, también se reivindica la estimulación del crecimiento de una célula o tejido vegetal disminuyendo la disponibilidad intracelular de trehalosa-6-fosfato. Nuevamente, como se muestra en la bibliografía reciente, esto indica que el balance de T6P es muy delicado, y está lejos de ser sencillo. Se llevó a cabo la modulación del contenido de T6P expresando genes heterólogos de TPS y TPP en la planta. Aunque la patente menciona que se pueden obtener resultados similares mediante un aumento o disminución de los genes endógenos, se podría esperar que, debido al gran número de genes vegetales, la supresión o sobreexpresión de uno de esos genes tiene sólo un efecto limitado sobre la concentración de T6P, si es que la tiene en absoluto. Esto es especialmente cierto para los genes de TPS de clase II, en los que están presentes tanto un dominio semejante a sintasa como un dominio semejante a fosfatasa. Si ambos dominios están activos, el producto final sería trehalosa en lugar de T6P. Además, para al menos dos genes de TPS de clase II de Arabidopsis, AtTPS7 y AtTPS8, no se pudo detectar ninguna actividad de sintasa ni de fosfatasa (Vogel et al., 2001; Eastmond et al., 2003) , dando a entender que una manipulación de estos genes no afectaría en absoluto al contenido de T6P de la planta.

Sorprendentemente, se encontró que la inactivación de una TPS de clase II vegetal se puede usar para promover el crecimiento vegetal y la producción de biomasa. De hecho, contrariamente a lo que se podría esperar en base a la bibliografía, la inactivación de la actividad de TPS vegetal conduce a un incremento del crecimiento del tallo y de las raíces, y a un aumento de la biomasa vegetal.

Un primer aspecto de la invención es el uso de la inactivación de una TPS de clase II vegetal para la promoción del crecimiento vegetal. El término “vegetal”, como se usa aquí, engloba plantas completas, ancestros y progenie de las plantas, y partes vegetales, incluyendo semillas, brotes, tallos, hojas, raíces (incluyendo tubérculos) , flores, y tejidos y órganos, en el que cada uno de los mencionados anteriormente comprende el gen/ácido nucleico de interés. El término “vegetal” también engloba células vegetales, cultivos en suspensión, tejido de callo, embriones, regiones meristemáticas, gametofitos, esporofitos, polen y microesporas, en el que, nuevamente, cada uno de los mencionados anteriormente comprende el gen/ácido nucleico de interés. Las plantas que son particularmente útiles en los métodos de la invención incluyen todas las plantas que pertenecen a la superfamilia Viridiplantae, en particular plantas monocotiledóneas y dicotiledóneas. Como ejemplo no limitante, puede ser una cosecha usada para alimento o forraje, por lo que el incremento de raíces, hojas, tallo o biomasa de semillas aumenta el rendimiento de la cosecha. Como alternativa, la cosecha se puede usar con fines ornamentales o industriales, tal como la producción de almidón, o se puede usar como materia prima para la producción de biocombustible. Las cosechas conocidas para biocombustible son conocidas por la persona experta en la técnica, e incluyen, pero no se limitan a,

cosechas alimentarias tales como maíz, haba de soja, linaza, colza, caña de azúcar, cosechas industriales, tales como cáñamo y panizo de pradera, pero también biomasa maderera tal como álamo y sauce.

TPS, como se usa aquí, se refiere a la homología estructural del gen y proteína con otros miembros de la familia de trehalosa-6-fosfato, pero no implica que la proteína tiene una actividad sintetizadora de trehalosa-6-fosfato efectiva. Preferiblemente, dicha TPS tiene un dominio homólogo a la glucosil transferasa 20 (pfam00982.12) . El término “dominio” se refiere a un conjunto de aminoácidos conservados en posiciones específicas a lo largo de un alineamiento de secuencias de proteínas evolutivamente relacionadas. Mientras que los aminoácidos en otras posiciones pueden variar entre homólogos, los aminoácidos que están muy conservados en posiciones específicas indican aminoácidos que son probablemente esenciales en la estructura, estabilidad o actividad de una proteína. Identificados mediante su grado elevado de conservación en secuencias alineadas de una familia de homólogos proteicos, se pueden usar como identificadores para determinar si cualquier polipéptido en cuestión pertenece a una familia polipeptídica previamente identificada. Como ejemplo no limitante, debido a su estructura, TPS, como se usa aquí, puede tener una actividad de T6P fosfatasa, o una combinación de actividad de sintasa y fosfatasa. El uso de la inactivación de TPS, como se menciona aquí, cubre el uso de la inactivación del gen, el uso de la inactivación de la proteína, así como el uso de compuestos que disminuyen la actividad de la proteína. Como ejemplo no limitante, un compuesto que disminuye la actividad de la TPS puede ser un anticuerpo inactivador anti-TPS.

Preferiblemente dicha TPS es una TPS de clase II, según la clasificación en Arabidopsis thaliana. Una TPS de clase II comprende tanto un dominio semejante a trehalosa-6-fosfato sintasa, así como un dominio semejante a trehalosa6-fosfato fosfatasa (Leyman et al, 2001, Vogel et al., 2001) ; preferiblemente, dicha TPS de clase II comprende un dominio semejante a trehalosa-6-fosfato sintasa, así como un dominio semejante a trehalosa-6-fosfato fosfatasa que comprende una caja de fosfatasa con la secuencia LDYD (G/D) T y/o una caja de fosfatasa con la secuencia GDD (R/Q) SD; más preferiblemente, dicha TPS de clase II comprende tanto un dominio semejante a trehalosa-6fosfato sintasa como un dominio semejante a trehalosa-6-fosfato... [Seguir leyendo]

1. El uso de la inactivación de una trehalosa-6-fosfato sintasa de clase II vegetal para promover el crecimiento vegetal.

2. El uso según la reivindicación 1, por lo cual dicha promoción del crecimiento vegetal es aumento del crecimiento 5 de las raíces, aumento del grosor del tallo, aumento del número de hojas y/o aumento del tamaño de las semillas.

3. El uso según cualquiera de las reivindicaciones anteriores, por lo cual dicha promoción del crecimiento vegetal se obtiene en ausencia de luz.

4. El uso de la inactivación de una trehalosa-6-fosfato sintasa vegetal de clase II para incrementar la síntesis del almidón.

5. El uso según cualquiera de las reivindicaciones anteriores, por lo cual dicha trehalosa-6-fosfato sintasa se selecciona del grupo que consiste en SEC ID Nº 1-15.

6. El uso según la reivindicación 5, por lo que dicha trehalosa-6-fosfato sintasa consiste en SEC ID Nº 4.

7. El uso según la reivindicación 6, por lo que dicha trehalosa-6-fosfato sintasa consiste en SEC ID Nº 1.

Figura 1: Longitud de las raíces de AtTPS8 KO en diferentes condiciones. GT2, GT4 y GT6 son diferentes líneas KO de AtTPS8

Líneas AtTPS8 KO en medio MS+sac Líneas AtPS8 KO en medio MS-sac AtTPS8 KO en medio + sac en la oscuridad Líneas AtTPS8 KO en medio -sac en la oscuridad Figura 2: Niveles de expresión de AtCYD3 y ApL3 en el contexto de AtTPS8 KO Expresión de ApL3

Expresión de AtCYCD3 Figura 3: Caracterización fenotípica de las plantas adultas con AtTPS8 KO en comparación con plantas WT

Hoja caulinares Figura 4

Figura 5 Figura 6

Figura 7 Figura 8: Expresión de TPS5 en la línea GT12622 con relación a la expresión de (Landsberg erecta) de WT

Figura 9 Figura 10