Un método para inducir la expresión de Foxp3 en una célula T que comprende

(i) estimular una célula T in vitro

(ii) inhibir la señalización in vitro a través de PI3K alfa o PI3K delta o m-TOR o Akt en dicha célula T,

en donde dicha inhibición se comienza de 10 a 22 horas después de la estimulación de (i).

Uso de inhibidores PI3K y AKT para inducir la expresión de FOXP3 y generar células T reguladoras.

Campo de la invención.

La invención se refiere a los nuevos usos de inhibidores de la fosfatidil inositol-3-cinasa (PI3K) . En particular, la invención se refiere a nuevos métodos para la inducción de la expresión de Foxp3 en las células T.

Fundamento de la invención.

Las células T reguladoras (células Treg) son esenciales para prevenir la autoinmunidad y la patología inmunológica, que son causadas por las células T efectoras en ausencia de células Treg. Las intervenciones inmunológicas destinadas a restringir las células T efectoras (para limitar la autoinmunidad y la patología inmunológica) o reforzar las respuestas inmunitarias (por ejemplo, contra tumores) requieren planteamientos que cambian el equilibrio entre las células Treg y las células T efectoras. Los planteamientos actuales son lentos, ineficaces, descansan en el uso de péptidos bioactivos purificados a partir de fuentes biológicas, o en la expansión de las células Treg pre-existentes.

La expresión del regulador transcripcional Foxp3, una proteína intracelular y miembro de la familia de reguladores transcripcionales forkhead/winged-helix (dominio en cabeza de tenedor) , es característica de las células Treg.

Se sabe que el tratamiento de las células T con el péptido bioactivo TGFbeta induce la expresión de novo de Foxp3 (Chen et al., 2003 J. Exp. Med. Vol. 198, pp 1875 - 1886) .

Se ha publicado que determinados protocolos de inmunización in vivo inducen la expresión de Foxp3 en las células T transgénicas receptoras de células T (Kretschmer et al., 2005 Nature Immunol. Vol. 6, p 1219) . Este planteamiento requiere el conocimiento tanto de la especificidad para el antígeno como de la restricción de MHC de las células T diana, de forma que el antígeno utilizado para la inmunización se puede seleccionar de acuerdo con ello. Esta condición es satisfecha por sistemas experimentales artificiales en los que las células T llevan receptores de células T transgénicas. Un problema con este planteamiento es que esta condición no se cumple para enfermedades autoinmunitarias de origen natural.

El inhibidor de mTOR rapamicina (sirolimus) se ha utilizado para manipular a la expansión de las células Treg preexistentes que expresan Foxp3 (Zheng et al, 2003 Immunity vol 19 p 503;.. Battaglia et al, 2005 Blood vol 105 p 4743) . Sin embargo, se ha demostrado que tales tratamientos no inducen la expresión de novo de Foxp3, lo que es un problema. Por ejemplo, Battaglia et al (ibid) señalan: “La presencia de células Tr CD4 CD25 … en cultivos de células T expuestos a rapamicina puede ser debida a una inducción de novo de células CD25 Tr a partir de células T CD25, o bien a una expansión selectiva del subconjunto de células Tr FoxP3 CD4 CD25 de origen natural ya presentes en cantidades limitadas al comienzo del cultivo (es decir, el 10% de las células T CD4 CD25bright que se encuentran normalmente en el bazo no tratado) . Para enfocar esta cuestión, células T CD4 agotadas de células Tr CD25 se cultivaron durante 3 semanas en presencia o en ausencia de rapamicina. Al contrario que con las células T CD4 (Figura 3A) , las células T CD4 CD25 activadas en presencia de rapamicina dieron lugar a una población de células T que no lograron suprimir la proliferación celular in vitro (Figura 4A) . En consecuencia, la expresión de FoxP3 fue potenciada en las células T CD4 expuestas a rapamicina, pero no en las células T CD4 CD25 tratadas con rapamicina (Figura 4B) ”. Además, los protocolos empleados se basan en múltiples rondas de estimulación in vitro a lo largo de varias semanas, lo que tiene el inconveniente de que es muy laborioso. Los efectos negativos de la rapamicina sobre el número de células Treg también han sido publicados en la técnica.

Un estudio de Valmori Danila et al. “El enriquecimiento mediado por rapamicina de células T con actividad reguladora en cultivos simulados de células T CD4+ no se debe a la expansión selectiva de las células T reguladoras de origen natural sino a la inducción de funciones reguladoras en células T CD4+ convencionales“. El trabajo JOURNAL OF IMMUNOLOGY 15 JUL 2006, vol. 177, nº 2, 15 julio 2006 () , páginas 944 – 949 describe el uso de rapamicina para diferenciar células T en células Treg, por administración concomitante de rapamicina y activación de la célula T. Sin embargo, los efectos son temporales y reversibles y requieren la presencia continua de rapamicina.

Así pues, los métodos de la técnica anterior se operan típicamente a través de la estimulación o la activación de Tregs existentes que pueden potenciar la expresión de Foxp3 en las células que lo expresan ya, o se basan en el bloqueo de no Tregs, que lleva a la expansión/selección o sobre-representación de Tregs en la población. Estos resultados son los mismos que el tratamiento de rapamicina, como se indicó anteriormente. Otro ejemplo es el uso de TGFbeta que típicamente potencia un nivel de expresión de Foxp3 ya presente. Ninguno de tales planteamientos conducen a la expresión de Foxp3 de novo / Tregs de novo.

El gene targeting (apuntar a un gen) de la isoenzima PI3K p110delta tiene por resultado el aumento del número de células Treg en el timo, pero la disminución del número de células Treg en los órganos linfoides periféricos. Esto va acompañado de la enfermedad inflamatoria intestinal, que suele estar relacionada con deficiencias de células T reguladoras. No pueden extraerse de estos estudios conclusiones claras acerca de la relación entre la señalización de PI3K y la expresión de Foxp3.

Los inhibidores de la isoenzima PI3K p110gamma son objeto de evaluación para el tratamiento de enfermedades autoinmunitarias basadas en mecanismos distintos de las células Treg.

El documento WO2004/032867A3 describe moléculas asociadas preferentemente con células T efectoras o células T reguladoras, y los métodos para usarlas. Este documento presenta estudios a nivel de población. Los inhibidores de PI3K se mencionan en la página 76 de este documento y en la figura 23A. Los efectos sobre la expresión de Foxp3 (si los hay - altas dosis de inhibidor de acuerdo con este documento son probablemente citotóxicas y podría decirse que las dosis bajas no muestran ningún efecto significativo) parece ser debido a una expansión de las células que expresan Foxp3, o una potenciación en la expresión de Foxp3 en las células que expresan Foxp3. No hay evidencia de expresión de Foxp3 de novo en las enseñanzas del documento WO2004/032867A3. El principio fundamental de este documento es un intento de inclinar el equilibrio del sistema inmunitario, por ejemplo, para tratar de reducir la autoinmunidad en general o para tratar de mejorar en general las respuestas. No hay ninguna enseñanza de hacer nuevas Tregs, y ninguna sugerencia hacia ello. Su método en el mejor de los casos enseña que las células en reposo (PBL) son simultáneamente activadas (CD3/CD28) e inhibidas (LY294002) , es decir, la activación y la estimulación al mismo tiempo. Al igual que otros estudios de la técnica (por ejemplo, Battaglia (ibíd.) ) , y en común con los propios estudios de los autores de la presente invención, estos tratamientos no generan la expresión Foxp3 de novo /Tregs de novo.

El documento US2004/0072766 describe métodos para modular las respuestas de células T mediante la manipulación de la transducción de señal intracelular. Los métodos descritos en este documento implican la adición de estimuladores e inhibidores juntos, esto es, a la vez o simultáneamente. No se genera ninguna expresión de Poxp3 de novo en este planteamiento.

Foey et al (Arthritis Res 2002 vol 4 pp 64 - 70) describen que las células T estimuladas por citocinas inducen la producción de IL-10 de macrófagos dependiendo de la fosfatidil inositol 3-cinasa y p70S6K, y las implicaciones para la artritis reumatoide. Esto está relacionado con el estudio de los macrófagos en presencia de células T. Las células T se fijaron para separar los efectos antes y después del contacto. Así pues, las células se fijan y ya no viven más cuando se añaden los inhibidores de PI3K en estos métodos. Así pues, por estos métodos no se produce ninguna expresión de Foxp3 de novo.

Breslin et al describen que la rapamicina y LY294002 colaboran inhibiendo la proliferación de células T. En este ejemplo, en común con otros estudios, implica exponer las células T a inhibidores con el fin de... [Seguir leyendo]

1. Un método para inducir la expresión de Foxp3 en una célula T que comprende (i) estimular una célula T in vitro

(ii) inhibir la señalización in vitro a través de PI3K alfa o PI3K delta o m-TOR o Akt en dicha célula T, en donde dicha inhibición se comienza de 10 a 22 horas después de la estimulación de (i) .

2. Un método para inducir la expresión de Foxp3 en una célula T previamente estimulada, que comprende inhibir la señalización in vitro en dicha célula T a través de PI3K alfa o PI3K delta o m-TOR o Akt, en el que dicha inhibición se comienza de 10 a 22 horas después de la estimulación.

3. Un método según cualquiera de las reivindicaciones 1 o 2, en el que dicha inhibición se comienza aproximadamente de 17 a 19 horas después de la estimulación.

4. Un método según la reivindicación 3, en el que dicha inhibición se comienza aproximadamente 18 horas después de la estimulación.

5. Un método según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4, en el que la etapa de señalización comprende inhibir la señalización a través de la inhibición de PI3K alfa o PI3K delta.

6. Un método según la reivindicación 5 en el que la inhibición de la señalización a través de PI3K alfa o de PI3K delta comprende poner en contacto dicha célula con el inhibidor de PI3K, y en el que dicho inhibidor inhibe PI3K alfa y/o PI3K delta.

7. Un método según cualquiera de las reivindicaciones precedentes, que comprende además retirar dicha estimulación no más tarde del momento de inhibir la señalización.

8. Un método según cualquiera de las reivindicaciones precedentes, en el que estimular dicha célula T comprende estimular dicha célula T a través del receptor de células T (TCR) .

9. El uso de un inhibidor de PI3K en la inducción in vitro de la diferenciación de una célula T en una célula T reguladora, en el que dicho inhibidor inhibe PI3K alfa y/o PI3K delta, en el que dicha inhibición se comienza de 10 a 22 horas después de la estimulación de la célula T.

10. El uso de un inhibidor de PI3K en la inducción in vitro de la expresión de Foxp3 en una célula T, en el que dicho inhibidor inhibe PI3K alfa y/o PI3K delta, en el que dicha inhibición se comienza de 10 a 22 horas después de la estimulación de la célula T.

11. Un método para generar una célula T reguladora, que comprende

(i) estimular una célula T in vitro

(ii) inhibir la señalización in vitro a través de PI3K alfa y/o PI3K delta o m-TOR o Akt en dicha célula T, en el que dicha inhibición se comienza de 10 a 22 horas después de la estimulación de (i) .

12. Un método para generar una célula T reguladora, que comprende tratar in vitro una célula T CD8– estimulada, con inhibidor de fosfatidil inositol 3 cinasa (PI3K) , en el que dicho inhibidor inhibe PI3K alfa y/o PI3K delta, en el que dicha inhibición se comienza de 10 a 22 horas después de la estimulación de la célula T.

13. Un método según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 8, u 11 o 12, o un uso según cualquiera de las reivindicaciones 9 a 10, en el que dicho inhibidor de PI3K comprende LY 294002.

Figura 1. La privación de la señal de TCR induce la expresión de Foxp3 por células T recién activadas en sinergismo con inhibidores de la ruta de PI3-K/mTOR

Figura 2: La señalización de TCR controla la actividad de mTOR en células T CD4 recién activadas.

Figura 3. La inducción de Foxp3 por privación de la señal de TCR e inhibidores de PI3K/mTOR es estable y tiene como resultado la adquisición de la función reguladora.

Figura 4. Expresión de Foxp3 en respuesta a la privación de señal e inhibición de PI3K/mTOR in vivo. Figura 5. Implicación diferencial de isoenzimas p110 en la inducción de Foxp3.

Figura 6. La inducción de Foxp3 por inhibidores de señalización de PI3K/mTOR es independiente de TGFβ.

Figura 7. Figura 8 Figura 9 Figura 10

células Figura 11 Figura 12 Figura 13