SUBTIPOS DEL RECEPTOR METABOTRÓPICO DE GLUTAMATO HUMANO (HMR6) Y COMPUESTOS DE ADN RELACIONADOS.

Un receptor metabotrópico de glutamato (hmGluR) humano purificado que comprende un polipéptido que tiene la secuencia de aminoácidos expuesta en la SEQ ID NO: 16.

Subtipos del receptor metabotrópico de glutamato humano (HMR6) y compuestos de ADN relacionados La presente invención se relaciona con proteínas del receptor metabotrópico de glutamato humano (hmGluR), con ácidos nucleicos aislados que las codifican, con las células huésped que producen las proteínas de la invención, con los métodos para la preparación de tales proteínas, con ácidos nucleicos y con células huésped, y con los usos de los mismos. Además, la invención provee anticuerpos dirigidos contra las proteínas hmGluR de la invención. Los receptores metabotrópicos de glutamato (hmGluR) pertenecen a la clase de receptores acoplados a la proteína G (proteína que enlaza al nucleótido guanina) que después de enlazamiento de un ligando glutamatérgico puede transducir una señal extracelular a través de un segundo sistema mensajero intracelular tal como los iones de calcio, un nucleótido cíclico, diacilglicerol e inositol 1,4,5-trifosfato en una respuesta fisiológica. Poseyendo siete segmentos putativos que se extienden transmembrana, precedidos por un gran dominio extracelular en el terminal amino y seguido por un gran dominio en el terminal carboxilo, los receptores metabotrópicos de glutamato se caracterizan por una estructura común. Con base en el grado de identidad de secuencia a nivel de aminoácidos la clase de mGluR se puede dividir en diferentes subfamilias que comprenden subtipos individuales de receptores (Nakanishi, Science 258, 597 - 603 (1992)). Cada subtipo de mGluR es codificado por un gen único. Con relación a la homología de un subtipo individual de mGluR con otro subtipo de subfamilia diferente, las secuencias de aminoácidos son aproximadamente menos de un 50% idénticas. Dentro de una subfamilia el grado de identidad de secuencia es generalmente aproximadamente menor al 70 %. De este modo, un subtipo particular puede ser caracterizado por su homología de secuencia de aminoácidos con otro subtipo de mGluR, especialmente un subtipo de la misma especie de mamífero. Además, un subtipo particular se puede caracterizar por su distribución de tejido y de región, su patrón de expresión celular y subcelular o por su perfil fisiológico inconfundible, por ejemplo por sus propiedades electrofisiológicas y farmacológicas. Siendo el aminoácido L-glutamato el principal neurotransmisor excitador, se presume que los sistemas glutamatérgicos juegan un papel importante en numerosos procesos neuronales incluida la transmisión excitatoria 25 sináptica rápida, la regulación de liberaciones de neurotransmisor, potenciación a largo plazo, aprendizaje y memoria, plasticidad en el desarrollo sináptico, daño hipóxico isquémico y muerte de las células neuronales, convulsiones epileptiformes, así como la patogénesis de diferentes trastornos neurodegenerativos. Hasta la fecha, no hay información disponible sobre subtipos del receptor metabotrópico de glutamato humano (hmGluR), por ejemplo sobre su secuencia de aminoácidos o distribución en el tejido. Esta falta de conocimiento obstaculiza 30 particularmente la búsqueda de agentes terapéuticos humanos capaces de influir específicamente sobre cualquier trastorno atribuible a un defecto en el sistema glutamatérgico. En vista del potencial fisiológico y de la significación patológica de los receptores metabotrópicos de glutamato, existe la necesidad por subtipos de receptores humanos y por células que produzcan tales subtipos en cantidad suficiente para elucidar las propiedades electrofisiológicas y farmacológicas de estas proteínas. Por ejemplo, los ensayos de selección de fármacos requieren de proteínas purificadas del receptor humano en forma activa, que aún no hayan sido conseguidas.   Un objetivo de la presente invención es satisfacer esta necesidad, es decir proveer diferentes subtipos de hmGluR, de ácidos nucleicos que las codifiquen y de células huésped que produzcan tales subtipos. En particular, la presente invención divulga la subfamilia de hmGluR que incluye al subtipo denominado como hmGluR4, y las proteínas individuales de dicha subfamilia. En lo sucesivo, dicha subfamilia será denominada como la subfamilia hmGluR4. Contrariamente a otros subtipos de hmGluR, los miembros de esta subfamilia son activados en forma potente por el ácido L-2-amino-4-fosfobutírico (AP4) y, cuando son expresados por ejemplo en células de ovario de hámster chino (CHO) o en células de riñón de una cría de hámster (BHK), acoplados en forma negativa a adenilato ciclasa a través de la proteína G. Utilizando un sistema que comprende un subtipo de hmGluR recombinante de la invención en la selección para fármacos reactivos al hmGluR ofrece (entre otros) las posibilidades de alcanzar un mayor número de receptores por célula produciendo mayor rendimiento de reactivo y una mayor relación de señal a ruido en los ensayos así como una mayor especificidad del subtipo de receptor (resultando potencialmente en una mayor especificidad biológica y por la enfermedad). La presente invención divulga además un subtipo de hmGluR caracterizado porque su secuencia de aminoácidos es aproximadamente más de 65 % idéntica a la secuencia del subtipo de hmGluR4 que tiene la secuencia de aminoácidos descrita en la SEQ ID NO: 2. De acuerdo con la invención, la expresión "subtipo de hmGluR" se refiere a una proteína purificada que pertenece a la clase de receptores acoplados a la proteína G y que por enlazamiento de un ligando glutamatérgico transduce una señal extracelular a través de un segundo sistema mensajero intracelular. En tal caso, un subtipo de la invención se caracteriza porque modifica el nivel de un nucleótido cíclico (cAMP, cGMP). Alternativamente, la transducción de la señal puede presentare a través de interacción directa de la proteína G acoplada a un subtipo de receptor de la invención con otra proteína de la membrana, tal como un canal iónico u otro receptor. Un subtipo de receptor de la invención se cree que es codificado por un gen distinto que no codifica. 2 E01124391 29-11-2011 WO9210583 divulga la identificación, aislamiento y purificación de receptores metabotrópicos de glutamato acoplados a proteína G de rata y anticuerpos de los mismos. Nakajima et al (1993) JBC, 268, 11868 - 11873 divulga la clonación y caracterización molecular de un receptor metabotrópico de glutamato a partir de una biblioteca de ADNc de retina de rata, otro subtipo de receptor metabotrópico de glutamato. Un subtipo particular de la invención puede ser caracterizado por su perfil fisiológico diferente, preferiblemente por su transducción de señal y propiedades farmacológicas. Propiedades farmacológicas son por ejemplo la selectividad por respuestas agonistas y antagonistas. Como se define aquí, un ligando glutamatérgico es por ejemplo L-glutamato u otro compuesto que interactúa con, y particularmente que se enlaza con, un subtipo de hmGluR en una forma como la del glutamato, tal como el ACPD 10 (ácido 1S,3R-1-aminociclopentano-1,3-dicarboxílico), un ligando como el ACPD, por ejemplo QUIS (quiscualato), AP4, y similares. Otros ligandos, por ejemplo (R,S)--metilcarboxifenilglicina (MCPG) o -metil-L-AP4, pueden interactuar con un receptor de la invención de tal forma que se evita el enlazamiento del ligando glutamatérgico. Como se lo utilizó aquí anteriormente o más adelante, los términos "purificado" o "aislado" se refieren a una molécula de la invención en forma pura o enriquecida que puede ser obtenida a partir de una fuente natural o por medio de ingeniería genética. Las proteínas purificadas, los ADN y los ARN de la invención pueden ser útiles en formas en las que las proteínas, los ADN y los ARN tal y como se presentan en la naturaleza no lo son, tal como la identificación de compuestos que modulan selectivamente la expresión o la actividad de un hmGluR de la invención. El hmGluR purificado de la invención significa un miembro de la subfamilia del hmGluR4 que ha sido identificado y está libre de uno o más componentes de su ambiente natural. El hmGluR purificado incluye hmGluR purificado de la invención en un cultivo recombinante de células. La forma enriquecida de un subtipo de la invención se refiere a una preparación que contiene dicho subtipo en una concentración superior a la natural, por ejemplo una fracción de una membrana celular que contiene dicho subtipo. Si dicho subtipo está en forma pura está sustancialmente libre de otras macromoléculas, particularmente de contaminantes proteínicos de origen natural. Si se desea, el subtipo de la invención puede ser solubilizado. Un subtipo purificado preferido de hmGluR de la invención es una proteína recombinante. Preferiblemente, el subtipo de la invención está en un estado activo lo que significa que tiene tanto actividad de enlazamiento del ligando como de transducción de señal. La actividad del receptor... [Seguir leyendo]

1. Un receptor metabotrópico de glutamato (hmGluR) humano purificado que comprende un polipéptido que tiene la secuencia de aminoácidos expuesta en la SEQ ID NO: 16. 2. Un receptor de acuerdo con la reivindicación 1 que es un subtipo del hmGluR6 que comprende un polipéptido que tiene la secuencia de aminoácidos expuesta en la SEQ ID NO: 16. 3. Un receptor metabotrópico de glutamato humano purificado que es codificado por una secuencia de nucleótidos capaz de hibridar bajo condiciones de alta rigurosidad a la SEQ ID NO: 1 ó 15 y cuyo producto polipeptídico muestra bajo una condición estándar en el radioinmunoensayo de cAMP que AP-4 tiene un efecto agonístico en una concentración menor a 1 mM. 10 4. Un proceso para la preparación de un receptor de acuerdo con la reivindicación 1, 2, ó 3 que comprende la multiplicación in vitro o in vivo de una célula huésped adecuada transformada con un vector híbrido que comprende un casete de expresión que incluye un promotor y un ADN que codifica para tal receptor cuyo ADN es controlado por dicho promotor.   5. El uso de un receptor de acuerdo con la reivindicación 1, 2, ó 3 para el cribado de un compuesto que modula la actividad de dicho receptor. 6. Un ácido nucleico aislado que comprende un ácido nucleico que codifica para un receptor de acuerdo con la reivindicación 1, 2, ó 3. 7. Un ácido nucleico de acuerdo con la reivindicación 6 que es un ADN. 8. Un ADN de acuerdo con la reivindicación 7 seleccionado del grupo que consiste de los ADN que tienen la secuencia de nucleótidos expuesta en las SEQ ID Nos. 1 ó 15, respectivamente. 9. Un proceso para la preparación de un ácido nucleico de acuerdo con la reivindicación 7 que comprende síntesis química, tecnología de ADN recombinante o reacción en cadena de la polimerasa (PCR). 10. Un ADN de acuerdo con la reivindicación 7 que es un vector híbrido. 11. Una célula huésped que comprende un ADN de la reivindicación 10. 12. Una célula huésped eucariota que expresa el ADN de la reivindicación 10. 13. Una célula huésped de acuerdo con las reivindicaciones 11 ó 12 que es una célula de mamífero. 14. El uso de una célula huésped de acuerdo con la reivindicación 11 para el cribado de un compuesto que modula la actividad de un receptor de acuerdo con la reivindicación 1, 2, ó 3. 15. Un proceso para la preparación de una célula huésped de acuerdo con la reivindicación 11 que comprende la transfección o transformación de la célula huésped con el vector híbrido de la reivindicación 11. 16. ARNm purificado complementario del ADN de acuerdo con la reivindicación 8. 17. Un método para la identificación de ADN que codifica un subtipo del hmGluR de acuerdo con la reivindicación 1, 2, ó 3 que comprende poner en contacto ADN humano con una sonda, y la identificación del(de los) ADN que hibridan con dicha sonda, en donde dicha sonda es una sonda de ácido nucleico que comprende al menos 14 bases contiguas del ácido nucleico de acuerdo con la reivindicación 6 ó 7, o el complemento de la misma y que específicamente se enlaza con cualquier ácido nucleico de la reivindicación 6 ó 7, o el complemente de la misma, bajo condiciones de alta rigurosidad". 18. Un método para la identificación de compuestos que se enlazan con un subtipo del hmGluR que comprende el uso de una proteína del receptor de acuerdo con la reivindicación 1, 2, ó 3 en un ensayo de enlazamiento competitivo. 19. Un ensay para la identificación de compuestos que modulan la actividad de un subtipo del hmGluR de acuerdo con la reivindicación 1, 2, ó 3 que comprende 101   - poner en contacto las células de la reivindicación 12 con al menos un compuesto o señal cuya habilidad para modular la actividad de dicho subtipo de receptor se busca determinar, y posteriormente - analizar células por una diferencia en la respuesta funcional que puede ser atribuida a dicho receptor. 20. Un ensayo de acuerdo con la reivindicación 19 que comprende poner en contacto las células de acuerdo con la reivindicación 12 con al menos un compuesto o señal cuya habilidad para modular la actividad del segundo mensajero de un subtipo de receptor de la invención se busca determinar, y posteriormente - controlar dichas células por un cambio en el nivel de un segundo mensajero particular. 21. Un método para detectar un agonista de glutamato o un modulador alostérico de un subtipo del hmGluR de acuerdo con la reivindicación 1, 2, ó 3 que tiene actividad agonística que comprende las etapas de (a) exponer un compuesto a un subtipo del hmGluR de acuerdo con la reivindicación 1, 2, ó 3 acoplado con una ruta de respuesta, bajo condiciones y durante un tiempo suficiente para permitir la interacción del compuesto con el receptor y una respuesta asociada a través de la ruta, y (b) detectar un incremento o una disminución en la estimulación de la ruta de respuesta resultante de la interacción del compuesto con el subtipo del hmGluR, con relación a la ausencia del compuesto analizado y a partir de allí determinar la presencia de un agonista o un modulador alostérico que tiene actividad de tipo agonista. 22. Un método para identificar un antagonista de glutamato o un modulador alostérico de un subtipo del hmGluR de acuerdo con la reivindicación 1, 2, ó 3 que tiene actividad antagonista, dicho método comprendiendo las etapas de (a) exponer un compuesto en presencia de un agonista conocido de glutamato a un subtipo del hmGluR de acuerdo con la reivindicación 1, 2, ó 3 a una ruta de respuesta, bajo condiciones y durante un tiempo suficiente para permitir la interacción del agonista con el receptor y una respuesta asociada a través de la ruta, y (b) detectar una inhibición de la estimulación de la ruta de respuesta por parte del agonista resultante de la interacción del compuesto con el subtipo del hmGluR, con relación a la estimulación de la ruta de respuesta inducida por el agonista de glutamato solo, y a partir de allí determinar la presencia de un antagonista de glutamato o de un modulador alostérico que tiene actividad de tipo antagonista. 23. Un anticuerpo que específicamente se enlaza con una proteína de la reivindicación 1, 2, ó 3. 24. Un anticuerpo de acuerdo con la reivindicación 23 que es un anticuerpo policlonal. 25. Un anticuerpo de acuerdo con la reivindicación 23 que es un anticuerpo monoclonal. 26. Un método para modular la actividad e transducción de la señal de un subtipo del hmGluR de acuerdo con la reivindicación 1, 2, ó 3 que comprende poner en contacto dicho receptor con un anticuerpo de la reivindicación 24. 27. Un receptor de acuerdo con la reivindicación 1, 2, ó 3 que pude ser obtenido por medio de tecnología de ADN recombinante. 28. Una proteína de fusión que comprende un receptor de acuerdo con la reivindicación 1, 2, ó 3. 102