Un proceso para la detección de la presencia o ausencia de al menos unasecuencia diana de ácido nucléico que comprende:

i. añadir a una muestra que pueda contener dicha al menos unasecuencia diana una sonda de hibridación de oligonucleótidos conconformación doble que tiene una secuencia de complemento de dianahibridable a dicha al menos una secuencia diana flanqueada por un parde secuencias de brazo complementarias que pueden interactuar demanera reversible y son capaces de hibridar entre ellas para formar untallo dúplex y en el que las secuencias de brazo complementarias estánmarcadas, respectivamente, con un par de partes de marcadoresinteractivas, en las que al menos una de las partes de marcadorespuede modificar una característica físicamente medible de la otra partede marcador cuando se encuentra muy cerca de la otra parte demarcador mencionada, pero no cuando se encuentran losuficientemente separadas; y

ii. detectar a una temperatura que es al menos 5ºC más baja que latemperatura de fusión de dicho tallo dúplex, como indicador de lapresencia de dicha al menos una secuencia diana en la muestra, uncambio en la característica físicamente medible en condiciones en lasque la secuencia de complemento de diana hibrida con dicha al menosuna secuencia diana y las secuencias de brazo complementarias seseparan dando lugar a la disolución del dúplex.

Sonda de hibridación para la detección de ácido nucléico, tallos universales, métodos y kits

Descripción

[0001] La presente invención hace referencia al campo de los ensayos que incluye las sondas de hibridación de ácido nucléico. Los ensayos resultan útiles para la detección de genes específicos, segmentos génicos, moléculas de ARN u otros ácidos nucléicos. Tales ensayos se utilizan clínicamente para, por ejemplo, muestras de tejido, sangre y orina, así como en la investigación en tecnología alimentaria, agricultura y biología.

Antecedentes de la invención [0002] Las sondas de hibridación de ácido nucléico son utilizadas para detectar secuencias diana específicas en una mezcla compleja. Los ensayos de hibridación convencionales y heterogéneos, como los descritos en Gillespie and Spiegelman (1965) , normalmente comprenden las siguientes fases: inmovilización de al menos el ácido nucléico diana en papel, perlas o superficies de plástico, con o sin utilizar sondas de captura; adición de un exceso de sondas marcadas que son complementarias a la secuencia de la diana; hibridación; eliminación de las sondas no hibridadas; y detección de las sondas que continúan unidas a la diana inmovilizada. [0003] Las sondas no hibridadas son eliminadas mediante el lavado a fondo de los híbridos. Ésta es normalmente la parte del procedimiento que más tiempo ocupa, y a menudo utiliza formatos complejos como hibridación en sándwich. El uso de superficies sólidas alarga el tiempo que tarda la hibridación al restringir la movilidad de la diana, o el acceso a la misma. La gran área que presentan las superficies sólidas retiene no específicamente sondas no hibridadas, dando lugar a la señal de fondo. Además, las superficies sólidas pueden interferir con la señal de las sondas. El requisito de que los híbridos de la sonda-diana sean aislados excluye la detección in vivo y la detección concurrente de los ácidos nucléicos durante las reacciones de síntesis (detección en tiempo real) . [0004] Se conocen diversos esquemas de detección en fase de solución, a veces conocidos como ensayos homogéneos. Con “homogéneo” queremos decir ensayos que se llevan a cabo sin separar las sondas no hibridadas de los híbridos de la sondadiana. Estos esquemas a menudo utilizan el hecho de que la fluorescencia de numerosas etiquetas fluorescentes puede verse afectada por el entorno químico inmediato. Uno de estos esquemas está descrito por Heller et al. (1983) y también por Cardullo et al. (1988) . Utiliza un par de sondas de oligodeoxinucleótido complementarias a regiones contiguas de una cadena de ADN diana. Una sonda contiene un marcador fluorescente en su extremo 5’ y la otra sonda contiene un marcador fluorescente diferente en su extremo 3’. Cuando las sondas son hibridadas con la secuencia diana, los dos marcadores se encuentran muy cerca uno de otro. Al estimular la muestra con una luz de una frecuencia apropiada, se produce una transferencia de energía de resonancia fluorescente (FRET, en inglés) de un marcador al otro. Esta transferencia de energía produce un cambio medible en la respuesta espectral, señalando indirectamente la presencia de la diana. Estos marcadores a veces se conocen como pares de FRET. Sin embargo, las propiedades espectrales alteradas son sutiles, y los cambios son pequeños en relación con la señal de fondo. La monitorización exige instrumentos sofisticados, y, aun así, la sensibilidad se encuentra limitada. Además, la señal de hibridación es, en algunos casos, una señal negativa; es decir, la presencia de la diana da lugar a una reducción en la cantidad de fluorescencia medida a una longitud de onda determinada. [0005] Esta técnica requiere que dos sondas no asociadas se unan simultáneamente a una secuencia diana de una sola cadena. La cinética de esta hibridación de tres moléculas es demasiado lenta como para que esta técnica sea adecuada para la detección en tiempo real. Las exigencias de que la diana sea de una sola cadena hace que la técnica no sea adecuada para la detección in vivo de ácidos nucléicos de doble cadena. [0006] Otro esquema en fase de solución también utiliza un par sondas de oligodeoxinucleótido. Sin embargo, aquí las dos sondas son completamente complementarias tanto entre ellas como con las cadenas complementarias de un ADN diana (Morrison, 1987; Morrison, 1989; Morrison et al., 1989; Morrison and Stols, 1993) . Cada sonda incluye fluoróforo conjugado a su extremo 3’ y un extintor de fluorescencia conjugado a su extremo 5’. [0007] Cuando las dos sondas de oligonucleótido están anilladas entre sí, el fluoróforo de cada sonda se encuentra próximo al extintor de fluorescencia de la otra sonda. Si el marcador fluorescente es entonces estimulado mediante una frecuencia adecuada de luz, la fluorescencia es desactivada por el extintor de fluorescencia. Sin embargo, cuando una sonda está unida a la diana, no se da el efecto de extinción de la sonda complementaria. Las sondas son lo suficientemente largas para no desactivarse a sí mismas cuando se unen a la diana. [0008] En este tipo de ensayo, hay dos consideraciones del diseño opuestas. Es recomendable contar con una concentración alta de sondas para asegurar que la hibridación de las sondas con la diana sea rápida. También es recomendable contar con una concentración baja de sondas para que la señal de las sondas unidas a la diana no sea eclipsada por la señal de fondo de las sondas no hibridadas con la diana o con otras sondas. La situación requiere esperar un periodo relativamente largo para que la fluorescencia de fondo disminuya antes de leer la señal fluorescente. [0009] Los ensayos que siguen este esquema comienzan fundiendo una mezcla de sondas y muestra que puede contener secuencias diana. Después, se baja la temperatura, provocando la hibridación competitiva. Algunas sondas hibridarán con la diana, si la hay; algunas hibridarán con sondas complementarias; y algunas no hibridarán y crearán la señal de fondo. Se lleva a cabo un ensayo de control paralelo sin diana, obteniéndose sólo un nivel de fondo de fluorescencia. Si la muestra contiene suficiente diana, se obtiene un nivel detectablemente más alto de fluorescencia residual. [0010] Con este esquema es necesario retrasar la lectura de la fluorescencia residual durante un periodo de tiempo considerable para permitir que casi todo el exceso de sondas se anille a sus complementarias. Se debe llevar a cabo también una reacción de control paralela. Además, se utiliza una baja concentración de sondas para reducir el fondo fluorescente. Así, la cinética es pobre y da lugar a un ensayo inherentemente lento. Esto excluye la detección en tiempo real. Estos problemas son particularmente serios para las dianas de dos cadenas. Las sondas, así como las dianas, tienen que fundirse, lo que hace que el ensayo no sea adecuado para su uso in vivo. Además, la señal no es sólo residual, es una señal diferencial, mediante la comparación con un control externo. [0011] Se ha descrito otro esquema en fase de solución que utiliza el fenómeno conocido como desplazamiento de cadena descrito por Diamond et al., 1988, es decir, la patente estadounidense nº 4.766.062. Normalmente, estos ensayos implican un complejo de sonda de ácido nucléico bimolecular. Una cadena sencilla más corta que comprende un subconjunto de la secuencia diana se anilla a una sonda más larga de cadena sencilla que comprende la región completa de la sonda de unión a la diana. El complejo de sonda así descrito comprende partes de cadena sencilla y de doble cadena. Estas referencias sugerían que estos complejos de sonda podrían también comprender un marcador P32 unido a la cadena más corta o un fluoróforo y un extintor de fluorescencia que podrían situarse uno cerca del otro cuando se formara el compuesto de sonda. [0012] Se afirma que en los ensayos que utilizan estos compuestos de sonda, la detección de la diana se logra mediante un proceso de dos fases. Primero, la parte de cadena sencilla del compuesto hibrida con la diana. Se describe que el reconocimiento de la diana sigue a continuación cuando, mediante el mecanismo de prolongación del apareamiento, el ácido nucléico diana desplaza la cadena más corta que lleva el marcador del compuesto de sonda. Se afirma que la cadena con el marcador se libera en la solución, desde la que podrá ser aislada y detectada. En una configuración alternativa presentada como una sonda marcada con P32 para el procedimiento de captura, los dos ácidos nucléicos de cadena sencilla se unen en una sola molécula. [0013] Estos compuestos de sonda con desplazamiento de cadena tienen inconvenientes. El mecanismo consta de dos fases, en las que el complejo de sonda debe primero unirse a la diana,... [Seguir leyendo]

1. Un proceso para la detección de la presencia o ausencia de al menos una secuencia diana de ácido nucléico que comprende:

i. añadir a una muestra que pueda contener dicha al menos una secuencia diana una sonda de hibridación de oligonucleótidos con conformación doble que tiene una secuencia de complemento de diana hibridable a dicha al menos una secuencia diana flanqueada por un par de secuencias de brazo complementarias que pueden interactuar de manera reversible y son capaces de hibridar entre ellas para formar un tallo dúplex y en el que las secuencias de brazo complementarias están marcadas, respectivamente, con un par de partes de marcadores interactivas, en las que al menos una de las partes de marcadores puede modificar una característica físicamente medible de la otra parte de marcador cuando se encuentra muy cerca de la otra parte de marcador mencionada, pero no cuando se encuentran lo suficientemente separadas; y ii. detectar a una temperatura que es al menos 5ºC más baja que la temperatura de fusión de dicho tallo dúplex, como indicador de la presencia de dicha al menos una secuencia diana en la muestra, un cambio en la característica físicamente medible en condiciones en las que la secuencia de complemento de diana hibrida con dicha al menos una secuencia diana y las secuencias de brazo complementarias se separan dando lugar a la disolución del dúplex.

2. El proceso de la reivindicación 1 en el que el par de marcadores son una parte luminiscente y una parte extintora.

3. El proceso de la reivindicación 2 en el que el par de marcadores es un par de FRET y en el que la parte luminiscente es un fluoróforo, p.ej., EDANS, y la parte extintora es un extintor no fluorescente, p.ej., DABCYL.

4. El proceso de cualquiera de las reivindicaciones de la 1 a la 3 en el que dicha muestra es un tejido fijado y dicha detección es una detección in situ sin destrucción del tejido.

5. El proceso de cualquiera de las reivindicaciones de la 1 a la 3 en el que el proceso es un ensayo in vitro y la secuencia diana es una secuencia de ácido nucléico en una célula viva.

6. El proceso de cualquiera de las reivindicaciones de la 1 a la 3 en el que la muestra se encuentra en un gel.

7. El proceso de cualquiera de las reivindicaciones de la 1 a la 6 para la detección de la presencia o ausencia de al menos dos secuencias diana que comprende añadir a la muestra una sonda de conformación doble hibridable con cada secuencia diana y generar una señal que es diferente y no interfiere con la señal de otra sonda o sondas de conformación doble.