SISTEMA PARA LA EXPRESION DE PEPTIDOS SOBRE LA SUPERFICIE BACTERIANA.

Sistema de expresión de péptidos sobre la superficie bacteriana caracterizado porque se utiliza como región de anclaje a la membrana la secuencia conservada de la proteína MSP1a de Anaplasma marginale.

Tipo: Patente de Invención. Resumen de patente/invención. Número de Solicitud: P200801129.

Solicitante: CONSEJO SUPERIOR DE INVESTIGACIONES CIENTÍFICAS (CSIC)
UNIVERSIDAD DE CASTILLA LA MANCHA
.

Nacionalidad solicitante: España.

Provincia: MADRID.

Inventor/es: DE LA FUENTE GARCIA, CANALES GARCIA-MENOCAL.

Fecha de Solicitud: 16 de Abril de 2008.

Fecha de Publicación: .

Fecha de Concesión: 11 de Enero de 2012.

Clasificación Internacional de Patentes:

  • C07K14/29 SECCION C — QUIMICA; METALURGIA.C07 QUIMICA ORGANICA.C07K PEPTIDOS (péptidos que contienen β -anillos lactamas C07D; ipéptidos cíclicos que no tienen en su molécula ningún otro enlace peptídico más que los que forman su ciclo, p. ej. piperazina diones-2,5, C07D; alcaloides del cornezuelo del centeno de tipo péptido cíclico C07D 519/02;   proteínas monocelulares, enzimas C12N; procedimientos de obtención de péptidos por ingeniería genética C12N 15/00). › C07K 14/00 Péptidos con más de 20 aminoácidos; Gastrinas; Somatostatinas; Melanotropinas; Sus derivados. › de Rickettsiales (O).
  • C12N15/74 C […] › C12 BIOQUIMICA; CERVEZA; BEBIDAS ALCOHOLICAS; VINO; VINAGRE; MICROBIOLOGIA; ENZIMOLOGIA; TECNICAS DE MUTACION O DE GENETICA.C12N MICROORGANISMOS O ENZIMAS; COMPOSICIONES QUE LOS CONTIENEN (biocidas, productos que repelen o atraen a los animales nocivos, o reguladores del crecimiento de los vegetales, que contienen microorganismos virus, hongos microscópicos, enzimas, productos de fermentación o sustancias obtenidas por o extraídas de microorganismos o sustancias animales A01N 63/00; preparaciones de uso médico A61K; fertilizantes C05F ); PROPAGACION,CULTIVO O CONSERVACION DE MICROORGANISMOS; TECNICAS DE MUTACION O DE INGENIERIA GENETICA; MEDIOS DE CULTIVO (medios para ensayos microbiológicos C12Q 1/00). › C12N 15/00 Técnicas de mutación o de ingeniería genética; ADN o ARN relacionado con la ingeniería genética, vectores, p. ej. plásmidos, o su aislamiento, su preparación o su purificación; Utilización de huéspedes para ello (mutantes o microorganismos modificados por ingeniería genética C12N 1/00, C12N 5/00, C12N 7/00; nuevas plantas en sí A01H; reproducción de plantas por técnicas de cultivo de tejidos A01H 4/00; nuevas razas animales en sí A01K 67/00; utilización de preparaciones medicinales que contienen material genético que es introducido en células del cuerpo humano para tratar enfermedades genéticas, terapia génica A61K 48/00; péptidos en general C07K). › Vectores o sistemas de expresión especialmente adaptados a huéspedes procariotas distintos a E. coli, p. ej. Lactobacillus, Micromonospora.
  • C12N9/52 C12N […] › C12N 9/00 Enzimas, p. ej. ligasas (6.; Proenzimas; Composiciones que las contienen (preparaciones para la limpieza de los dientes que contienen enzimas A61K 8/66, A61Q 11/00; preparaciones de uso médico que contienen enzimas A61K 38/43; composiciones detergentes que contienen enzimas C11D ); Procesos para preparar, activar, inhibir, separar o purificar enzimas. › que provienen de bacterias.

Clasificación PCT:

  • A01K39/02 SECCION A — NECESIDADES CORRIENTES DE LA VIDA.A01 AGRICULTURA; SILVICULTURA; CRIA; CAZA; CAPTURA; PESCA.A01K CRIA; AVICULTURA, PISCICULTURA, APICULTURA; PESCA; OBTENCION DE ANIMALES, NO PREVISTA EN OTRO LUGAR; NUEVAS RAZAS DE ANIMALES.A01K 39/00 Aparatos para la alimentación y abrevado de las aves de corral u otras aves. › Abrevaderos (A01K 39/04 tiene prioridad).
  • C07K14/29 C07K 14/00 […] › de Rickettsiales (O).
  • C07K14/435 C07K 14/00 […] › de animales; de humanos.
  • C12N15/63 C12N 15/00 […] › Introducción de material genético extraño utilizando vectores; Vectores; Utilización de huéspedes para ello; Regulación de la expresión.
  • C12N15/70 C12N 15/00 […] › Vectores o sistemas de expresión especialmente adaptados a E. coli.

PDF original: ES-2352946_B1.pdf

 


Fragmento de la descripción:

Sistema para la expresión de péptidos sobre la superficie bacteriana. La presente invención se encuentra dentro de los sectores biotecnológico, bioquímico, y químico-farmacéutico. El objeto de la invención es un método para exponer polipéptidos recombinantes expresados sobre la superficie bacteriana. Podrá ser aplicado en investigaciones básicas o aplicadas en biología molecular, bioquímica, biotecnología o en la producción de proteínas recombinantes para diversos fines. Estado de la técnica anterior La tecnología que permite la expresión de una proteína o péptido, uniéndola a la superficie celular, por ejemplo de microorganismos como bacterias o levaduras, tiene numerosas aplicaciones dependiendo del tipo de proteína expresada en la superficie, y por tanto, un enorme interés industrial. Por eso, el interés por exponer proteínas o péptidos sobre la superficie de bacterias vivas ha ido en aumento en áreas de investigación bioquímica, de biología molecular y biotecnología. La exposición de proteínas heterólogas empleando motivos de anclaje a membrana de proteínas como los LamB, OmpA, PhoE, TratT, OprF, OprI, FHA, INP, fimbrias, y AIDA-I y el sistema de auto-exposición han servido ya para expresar antígenos y enzimas. La proteína que se desea exponer tiene que ser fusionada con la proteína o proteínas de anclaje, que son a menudo proteínas de la superficie celular o fragmentos de éstas (carrier proteins), mediante una fusión N-terminal, una fusión C-terminal, o una fusión sándwich. Las características de la proteína de anclaje, la proteína expuesta y el método de fusión afecta la eficiencia de la expresión en la superficie de proteínas. La expresión de proteínas en superficie tiene múltiples aplicaciones, incluyendo: a. el desarrollo de vacunas vivas, al exponer epítopos heterólogos de comensales humanos o células bacterianas patogénicas atenuadas para elicitar la respuesta de anticuerpos antígeno-específicos, b. la búsqueda de librerías de péptidos por unión secuencial y elusión o, más eficientemente por clasificación celular por fluorescencia (Fluorescence-activated cell-sorting, FACS), c. producción de anticuerpos expresando antígenos de superficie para obtener anticuerpos policlonales en animales, d. bioadsorventes para eliminar compuestos químicos perjudiciales y metales pesados, e. biocatálisis por inmovilización de enzimas, f. desarrollo de biosensores por anclaje de enzimas, receptores u otros componentes sensibles a señales para el diagnóstico, propósitos industriales o medioambientales, g. detección de cambios de aminoácidos en péptidos diana tras mutagénesis al azar. Anaplasma marginale (Rickettsiales: Anaplasmataceae) es un patógeno trasmitido por garrapatas que causa la anaplasmosis bovina, una enfermedad que ocasiona pérdidas económicas importantes en la producción ganadera. La proteína MSP1a (por sus siglas del inglés Major Surface Protein 1a) es una de las cinco proteínas principales de superficie conocidas de A. marginale y está involucrada en la adhesión del patógeno a los hospedadores y en las interacciones del patógeno con las garrapatas. Esta proteína ha evolucionado bajo una presión selectiva positiva y su tamaño molecular es diferente entre cepas de distintas áreas geográficas. Las variaciones se deben a que una secuencia de 23 a 31 aminoácidos consecutivos se repite distinto número de veces, en el extremo N-terminal, de la región que la proteína expone sobre la superficie bacteriana. Se ha demostrado que MSP1a permite a la bacteria adherirse a los eritrocitos bovinos y a las células de garrapatas. El dominio de adhesión de la proteína ha sido identificado precisamente en la región variable del extremo N-terminal que contiene los péptidos repetidos. La MSP1a también está involucrada en la transmisión de A. marginale por las garrapatas del género Dermacentor spp. y los péptidos repetidos del extremo N-terminal, que poseen epítopos celulares B, podrían estar involucrados en la respuesta protectiva del ganado frente a las infecciones por A. marginale. La garrapata Boophilus microplus (recientemente reclasificada como Rhipicephalus microplus) afecta considerablemente al ganado bovino de las regiones tropicales y subtropicales del planeta. El antígeno BM86, codificado por el gen Bm86, es una glicoproteína aislada de las células intestinales de R. microplus que ha sido utilizada en una vacuna contra las infestaciones por estas garrapatas. Un gen homólogo al Bm86, el Bm95, fue aislado también de una cepa de R. microplus (Cepa A) y su proteína codificante, la BM95, mostró capacidad protectora frente a un mayor número de cepas de garrapatas de diferentes regiones geográficas. Los primeros experimentos realizados por los inventores, caracterizaron la presencia de péptidos inmunogénicos en la proteína BM86. Posteriormente se demostró que estos péptidos eran los responsables de inducir la respuesta protectora del ganado vacunado frente a las infestaciones por garrapatas. 2 ES 2 352 946 A1 En la presente invención se demuestra que una proteína recombinante, compuesta por los péptidos inmunogénicos de BM95 fusionados con la región N-terminal de la proteína MSP1a de A. marginale, se expone sobre la superficie de células vivas de E. coli y es reconocida por anticuerpos anti-BM86 y anti-MSP1a. Este sistema aporta un modelo novedoso de exposición de proteínas heterólogas sobre células vivas de bacterias y además sugiere la posibilidad de emplear bacterias recombinantes en estudios de inmunización del ganado frente a infestaciones de garrapatas. Para el éxito de la expresión de la proteína en la superficie celular, el motivo de anclaje es el elemento más importante. Constituye el núcleo de esta tecnología la elección de un motivo capaz de expresar una proteína o péptido heterólogo en la superficie celular de forma efectiva. Una proteína de anclaje adecuada debe poseer los siguientes cuatro requerimientos: debe tener un transportador que permita a la proteína de fusión prematura pasar a través de la membrana interna; debe tener una fuerte estructura de anclaje para sostener las proteínas de fusión en la superficie celular; debe ser compatible con las secuencias externas a ser insertadas o fusionadas, y por último, debe ser resistente al ataque de las proteasas presentes en el medio o espacio periplásmico. Los sistemas de expresión conocidos hasta el momento presentan desventajas, siendo la fundamental la limitación para la presentación en membrana de polipéptidos con diferente número y composición de aminoácidos, uno de los aspectos principales que aborda el objeto de la presente invención. Descripción de la invención La presente invención se refiere al empleo de una porción de la proteína MSP1a de A. marginale para dirigir la exposición de otros péptidos sobre la superficie celular, mediante su fusión N-terminal con esta proteína. Teniendo en cuenta el rango de tamaño natural de los péptidos repetidos en la región N-terminal d e MSP1a (28-289 amino ácidos) y los ejemplos de realización expuestos en esta memoria, una ventaja de usar la proteína MSP1a en lugar de otros motivos de anclaje de proteínas de membrana para exponer péptidos sobre la superficie celular, es la posibilidad de exponer polipéptidos de diferentes tamaños y composición de aminoácidos. De acuerdo con un primer aspecto de la presente invención, se proporciona un sistema de expresión de péptidos sobre la superficie bacteriana, de aquí en adelante sistema de expresión de la invención, caracterizado porque comprende una región de anclaje a la membrana bacteriana y el péptido expuesto, donde se utiliza como región de anclaje a la membrana bacteriana cualquiera de las siguientes secuencias: a. Péptido que comprende la secuencia aminoacídica SEQ ID NO: 1. b. Una secuencia aminoacídica con una identidad de al menos 99%, 98%, 95%, 90%, o un 80% con la SEQ ID NO: 1. De aquí en adelante, por secuencia aminoacídica de la invención se entiende la secuencia de aminoácidos de la porción de la proteína MSP1a de Anaplasma marginale, o una proteína con una identidad de, al menos, el 80%, y más preferiblemente el 90%, el 95%, el 98%, y aún más preferiblemente el 99% con dicha porción de la proteína MSP1a, recogida en la SEQ ID NO: 1. Y se entenderá por péptido expuesto la secuencia de aminoácidos que se quiere expresar sobre la superficie bacteriana, y que está unida o fusionada a la secuencia aminoacídica de la invención. El término péptido, tal como se usa en la presente invención, incluye tanto la proteína de longitud completa, como las secuencias de polipéptidos y péptidos más cortas. El término polinucleótido o secuencia polinucleotídica, como aquí se usa, se refiere a una forma polimérica de nucleótidos de cualquier longitud, bien ribonucleótidos... [Seguir leyendo]

 


Reivindicaciones:

1. Sistema de expresión de péptidos sobre la superficie bacteriana caracterizado porque comprende una región de anclaje a la membrana bacteriana y el péptido expuesto, donde la región de anclaje a la membrana bacteriana es cualquiera de las siguientes secuencias: a. Péptido que comprende la secuencia aminoacídica SEQ ID NO: 1; o b. Una secuencia aminoacídica con una identidad de al menos un 99%, 98%, 95%, 90%, o un 80% con la SEQ ID NO: 1. 2. Sistema de expresión de péptidos según la reivindicación anterior, donde la bacteria es E. coli. 3. Construcción genética que comprende, al menos, uno de los siguientes tipos de secuencias: a. secuencia de nucleótidos que codifica la secuencia aminoacídica según cualquiera de las reivindicaciones 1-2, o b. moléculas de ácido nucléico cuya cadena complementaria híbrida con la secuencia polinucleotídica de a), c. moléculas de ácido nucléico cuya secuencia difiere de a) y/o b) debido a la degeneración del código genético, d. secuencia de nucleótidos de a), b), ó c), preferentemente de doble cadena, correspondiente a un sistema o vector de expresión génica, operativamente enlazada con, al menos, un promotor que dirija la transcripción de dicha secuencia de nucleótidos de interés, y con otras secuencias necesarias o apropiadas para la transcripción y su regulación adecuada en tiempo y lugar. 4. Plásmido que comprende la construcción genética según la reivindicación 3. 5. Método para elaborar el sistema de expresión de péptidos según cualquiera de las reivindicaciones 1-2, que comprende los siguientes pasos: a. Introducir una construcción genética según la reivindicación, 3 o un plásmido según la reivindicación 4, en una célula hospedante. b. Incubar la célula hospedante según a. en un medio de reacción adecuado. 6. Método según la reivindicación anterior, donde la célula hospedante es E. coli. 7. Péptido recombinante que comprende la secuencia aminoacídica de la invención y la secuencia de aminoácidos del péptido expuesto, obtenido a partir del sistema de expresión según cualquiera de las reivindicaciones 1-2, de la construcción genética según la reivindicación 3, o del plásmido según la reivindicación 4. 8. Sistema de expresión según cualquiera de las reivindicaciones 1-2, construcción genética según la reivindicación 3, plásmido según la reivindicación 4 o péptido recombinante según la reivindicación 7, para su uso como medicamento. 9. Sistema de expresión según la reivindicación anterior, donde el medicamento es una vacuna. 10. Sistema de expresión según cualquiera de las reivindicaciones 1-2, donde la secuencia de aminoácidos del péptido expuesto comprende la SEQ ID NO: 3. 11. Uso del sistema de expresión según la reivindicación anterior para la elaboración de una vacuna para inmunizar frente a garrapatas del género Rhipicephallus. 12. Uso del péptido recombinante según la reivindicación 7 como inmunógeno. 11 ES 2 352 946 A1 12 ES 2 352 946 A1 13 ES 2 352 946 A1 14 ES 2 352 946 A1 ES 2 352 946 A1 16 ES 2 352 946 A1 LISTA DE SECUENCIAS <110> Consejo Superior de Investigaciones Científicas (CSIC) Universidad de Castilla-La Mancha <120> Sistema para la expresión de péptidos sobre la superficie bacteriana. <130> 1641.27 <160> 11 <170> PatentIn version 3.4 <210> 1 <211> 529 <212> PRT <213> Anaplasma marginale <400> 1 1 ES 2 352 946 A1 2 <210> 2 <211> 1612 <212> DNA <213> Anaplasma marginale <400> 2 ES 2 352 946 A1 3 <210> 3 <211> 46 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> Proteína quimera BM95 <400> 3 ES 2 352 946 A1 4 <210> 4 <211> 569 <212> PRT <213> Rhipicephalus microplus (Boophilus microplus) <400> 4 ES 2 352 946 A1 ES 2 352 946 A1 6 <210> 5 <211> 83 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> oligonucleótido Bmtin5 <400> 5 <210> 6 <211> 85 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> oligonucleótido Bmtin3 <400> 6 <210> 7 <211> 33 <212> DNA <213> Artificial ES 2 352 946 A1 7 <220> <223> oligonucleótido B5 <400> 7 <210> 8 <211> 38 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> oligonucleótido B3 <400> 8 <210> 9 <211> 6950 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> plásmido pAF0R1 ES 2 352 946 A1 8 <400> 9 ES 2 352 946 A1 9 ES 2 352 946 A1 ES 2 352 946 A1 11 ES 2 352 946 A1 12 ES 2 352 946 A1 13 <210> 10 <211> 7090 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> plásmido pMBXAF3 <400> 10 ES 2 352 946 A1 14 ES 2 352 946 A1 ES 2 352 946 A1 16 ES 2 352 946 A1 17 ES 2 352 946 A1 18 ES 2 352 946 A1 19 <210> 11 <211> 583 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> proteína fusionada BM95-MSP1a <400> 11 ES 2 352 946 A1 OFICINA ESPAÑOLA DE PATENTES Y MARCAS ESPAÑA

 

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