Sistema para ensamblado de piezas genéticas.

La presente invención describe un sistema de ensamblado in vitro para piezas genéticas.

El ensamblado de fragmentos de DNA constituye la base de la ingeniería genética y la biología sintética. Para el diseño de nuevos circuitos genéticos, ambas disciplinas tienden hacia la generación de colecciones de piezas genéticas intercambiables y reciclables (es decir, susceptibles de ser utilizadas en laboratorios distintos y para generar combinaciones genéticas distintas), que puedan ser unidas entre sí mediante el uso de un método estándar de ensamblaje. Es particularmente necesario el desarrollo de métodos que permitan gran eficiencia y versatilidad en el ensamblaje de piezas en los rangos que van entre 5 y 50 piezas individuales, ya que la naturaleza modular de las interacciones genéticas hace que buena parte de la ingeniería se desarrolle en torno a diseños genéticos que abarcan estos rangos de tamaño.

Sistema para ensamblado de piezas genéticas

La presente invención se engloba en el sector técnico de la Biotecnología, la Biología Sintética y por extensión a la Biotecnología Agraria y Biología Sintética de Plantas para la creación de plantas transgénicas, cisgénicas y/o intragénicas con nuevos caracteres agronómicos.

ESTADO DE LA TÉCNICA ANTERIOR

El ensamblaje de estructuras funcionales básicas de DNA (denominadas de aquí en adelante “piezas” o “partes”) para producir nuevas combinaciones (referidas de aquí en adelante como “módulos”, o “dispositivos” si resultan del ensamblaje de dos o más módulos) constituye la herramienta básica de la Biología Sintética.

Tradicionalmente, el ensamblado múltiple de fragmentos de DNA se ha llevado a cabo sobre plásmidos que contienen un sitio de clonaje múltiple (MCS) . El MCS consiste en una secuencia de DNA con un número variable de dianas de enzimas de restricción tipo II (ERTII) . En esta metodología, el ensamblaje de uno o más fragmentos para formar estructuras de complejidad creciente se realiza por inserciones sucesivas de nuevas piezas, utilizando para ello las dianas de restricción presentes en el MCS. Las clonaciones múltiples basadas en MCS tradicionales tienen importantes limitaciones, fundamentalmente la presencia de dianas de restricción internas en los nuevos fragmentos a ensamblar, el número finito de dianas del MCS, la complejidad técnica, que incluye separación electroforética/purificación de los fragmentos, o la permanencia de las secuencias diana en las zonas de unión entre las partes ensambladas (referidas de aquí en adelante como “costuras de ensamblado” o simplemente “costuras”) . Todo ello hace que el método MCS tradicional no sea susceptible de estandarización y por tanto es susceptible de ser mejorado.

Como alternativa a MCS tradicional, se han venido desarrollando nuevos métodos de ensamblaje. La tendencia general es acercar el ensamblaje genético a los mecanismos habituales en otras ingenierías, y para ello se requieren cuatro características básicas:

(i) estandarización, es decir que las reglas de ensamblaje puedan aplicarse independientemente de la identidad de las partes;

(ii) reciclabilidad, es decir que los nuevos ensamblajes puedan reutilizarse para realizar ensamblajes más complejos;

(iii) eficiencia, es decir que permita la construcción de ensamblajes complejos de forma rápida y segura; y finalmente

(iv) simplicidad, es decir que el ensamblaje funcione con un conjunto mínimo de reglas sencillas para facilitar la automatización y la adopción del sistema por el usuario final.

Los métodos desarrollados en la actualidad son fundamentalmente de dos tipos: multipartitos, en los que el ensamblaje múltiple se realiza en un solo paso mediante adición de dos o más partes en tándem; o bien binarios, en los que el ensamblaje múltiple va creciendo paso a paso mediante uniones dos a dos de fragmentos ensamblados previamente.

Uno de los métodos más utilizados es el denominado “Gateway Cloning”, sujeto a las patentes US números 5888732, 6143557, 6171861, 6270969, 6277608, 6720140 y otras patentes pendientes pertenecientes a Invitrogen Corporation. El clonaje Gateway está basado en recombinación homóloga in vitro mediada por una mezcla de recombinasas denominadas BP y LR. En una elaboración ulterior se desarrolló el sistema Multisite Gateway (Invitrogen) , que permite el ensamblaje multipartito de hasta cuatro partes de forma direccional en un vector de destino. Varios vectores de ensamblaje multigénico se han desarrollado a partir de la tecnología Gateway (Chen et al., 2006, Chung et al., 2005) . A pesar de su alta eficiencia, el ensamblaje por Gateway cloning está limitado a un máximo de cuatro partes, lo que impide formar módulos de orden superior y/o dispositivos. Además la recombinación conduce a la formación de costuras (sitios attB) de 25 nucleótidos.

Un conjunto alternativo de metodologías (SLIC, Gibson, CPEC) está basado en la generación de fragmentos solapantes de simple cadena entre las “partes” a ensamblar. De esta forma el ensamblaje se estabiliza por apareamiento entre las cadenas complementarias, que posteriormente es cerrado covalentemente por ligasas o por la propia célula huésped. En todas estas tecnologías, las extensiones solapantes son introducidas por PCR, generando posteriormente los fragmentos de simple cadena mediante distintas técnicas. SLIC (Sequence and Ligase Independent Cloning) , produce los fragmentos de simple cadena mediante la actividad exonucleasa de la ligasa T4 (Aslanidis and de Jong, 1990, Li and Elledge, 2007) . El método de Gibson usa la polimerasa T5 perseguida por la polimerasa Phusion para generar y reparar la secuencias solapantes (Gibson et al., 2009) . Finalmente el método llamado Circular Polymerase Extension Cloning (Quan and Tian, 2009) , se basa en la actividad cebadora mutua de plásmido e inserto para ensamblar partes por PCR sin adición de oligonucleótidos. Todos estos sistemas de ensamblaje son multipartitos y generan ensamblajes sin costuras. Sin embargo, son bastante susceptibles de

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introducir errores, ya que están basados en PCR. Además, debido a que están basados en apareamientos de secuencias complementarias, son poco compatibles con la existencia de zonas con alta estructura secundaria, secuencias repetitivas, etc. Otras metodologías multipartitas emplean distintas herramientas como el uso enzimas de restricción con secuencias de reconocimiento largo (rare cutters) (Goderis et al., 2002) “homing endonucleases”, secuencias de recombinación (Lin et al., 2003) , o una combinación de dos o más de ellas como el kit ACEM (Bieniossek et al., 2009) (Berger, 2010) (WO/2010/100278) .

Otra metodología de ensamblaje multipartito descrita recientemente es el llamado método Golden Gate (Engler et al., 2009, Engler et al., 2008) . Está basado en el uso de enzimas de restricción de tipo IIS (ERTIIS) . A diferencia de los ERTII convencionales, en los cuales el sitio de reconocimiento es palindrómico y coincide con el sitio de digestión, los ERTIIS no tienen diana de corte sino que digieren algunos nucleótidos más allá del sitio de reconocimiento, independientemente de su secuencia, dejando extremos protuberantes generalmente de 4 nucleótidos. En Golden Gate, las partes a ensamblar están flanqueadas por dianas ERTIIS orientadas hacia dentro del fragmento. De esta forma la diana desaparece tras el ensamblaje, facilitando una unión sin costuras. Para el ensamblaje sólo se requiere una pequeña región solapante de 4 nucleótidos entre partes adyacentes, que se hace coincidir con la zona de corte del ERTIIS. En una reacción Golden Gate los fragmentos a ensamblar se incuban en presencia del ERTIIS y ligasa T4 en ciclos de digestión y ligación en un único tubo. Esta técnica aumenta notablemente la eficiencia de los ensamblajes pues evita tener que realizar extracción de gel de los fragmentos a clonar. Golden Gate es fácilmente estandarizable, sin embargo en su desarrollo inicial, las construcciones no eran reusables, lo que impide su adopción como estándar en Biología Sintética.

En una subsiguiente innovación técnica, denominada MoClo (Weber, Engler et al. 2011) , se introdujeron dos nuevos enzimas de restricción de tipo IIS en los plásmidos de destino, lo que permite la utilización de estos enzimas para una segunda ronda de ensamblaje multipartito. Con objeto de aproximarse al objetivo de reciclabilidad, el sistema MoClo introduce un nivel de ensamblaje llamado “intermedio” que consiste en adicionar un casete de selección negativa como una pieza más al final del ensamblaje. Esto permite crear versiones de construcciones múltiples “abiertas”, que si bien no pueden ser directamente transferidas a la célula ya que contienen una pieza superflua (cassete de selección) , sí que se puedan utilizar como molde sobre el que adicionar nuevas piezas y hacer así crecer la construcción en el futuro. El sistema MoClo es pues un sistema modular estandarizado susceptible de automatización. Aunque MoClo permite el crecimiento teóricamente indefinido de los ensamblajes Golden Gate, el diseño resultante presenta una serie de inconvenientes que complican su adopción por el usuario y que se enumeran a continuación:

(i) el sistema requiere el uso de tres enzimas de restricción para asegurar... [Seguir leyendo]

1. Un plásmido de destino (pDGB) para el ensamblaje in vitro de piezas de DNA de doble cadena, caracterizado porque comprende un esqueleto de un plásmido de DNA de doble cadena que comprende:

a) al menos un origen de replicación,

b) al menos un marcador de selección positiva,

c) al menos un cassete que permite selección negativa,

d) al menos 2 sitios de reconocimiento para una primera enzima de restricción de tipo IIS (E1) que dan lugar cada uno de ellos a un sitio de corte de 4 o más nucleótidos seleccionados entre 1, 2 y 3, siendo 1, 2 y 3 secuencias de cuatro nucleótidos cualesquiera distintas entre sí, y

e) al menos 2 sitios de reconocimiento para una segunda enzima de restricción de tipo IIS (E1) que dan lugar cada uno de ellos a un sitio de corte de 4 o más nucleótidos seleccionados entre A, B y C, siendo A, B y C secuencias de cuatro nucleótidos cualesquiera distintas entre sí de manera que los sitios de corte y reconocimiento citados en (d) y los sitios de corte y reconocimiento citados en (e) flanquean el cassete de selección citado en (c) en sus extremos 5´y 3´con orientaciones invertidas.

2. El plásmido de destino (pDGB) para el ensamblaje in vitro de piezas de DNA de doble cadena según la reivindicación 1, caracterizado porque las orientaciones invertidas de los sitios de corte y reconocimiento citados en (d) y los sitios de corte y reconocimiento citados en (e) flanqueando el cassete de selección citado en (c) en sus extremos 5´y 3´están seleccionadas entre: A12C, C12B, 1AB3, y 3AB2.

3. El plásmido de destino (pDGB) para el ensamblaje in vitro de piezas de DNA de doble cadena según la reivindicación 2, caracterizado porque la orientación de los dos sitios de corte y reconocimiento citados en (d) y los dos sitios de corte y reconocimiento citados en (e) es A12C, depositado en la Colección Española de Cultivos Tipo como CECT 7900.

4. El plásmido de destino (pDGB) para el ensamblaje in vitro de piezas de DNA de doble cadena según la reivindicación 2, caracterizado porque la orientación de los dos sitios de corte y reconocimiento citados en (d) y los dos sitios de corte y reconocimiento citados en (e) es C12B, depositado en la Colección Española de Cultivos Tipo como CECT 7899.

5. El plásmido de destino (pDGB) para el ensamblaje in vitro de piezas de DNA de doble cadena según la reivindicación 2, caracterizado porque la orientación de los dos sitios de corte y reconocimiento citados en (d) y los dos sitios de corte y reconocimiento citados en (e) es 1AB3, depositado en la Colección Española de Cultivos Tipo como CECT 7902.

6. El plásmido de destino (pDGB) para el ensamblaje in vitro de piezas de DNA de doble cadena según la reivindicación 2, caracterizado porque la orientación de los dos sitios de corte y reconocimiento citados en (d) y los dos sitios de corte y reconocimiento citados en (e) es 3AB2, depositado en la Colección Española de Cultivos Tipo como CECT 7901.

7. Un método de ensamblaje in vitro de piezas de DNA de doble cadena caracterizado porque comprende un bucle de ensamblaje indefinido que alterna el nivel α y el nivel Ω de ensamblaje binario quasi-idempotentes, donde el nivel α comprende las siguientes etapas:

i) construcción de los plásmidos de entrada (pE) de nivel α, cada plásmido de entrada (pE) de nivel α comprende una pieza de DNA de doble cadena seleccionada entre (Xi) y/o (Xj) , flanqueada en sus extremos 5´y 3´ por sendos sitios de corte y reconocimiento seleccionados entre 1, 2 y 3, para una primera enzima de restricción de tipo IIS (E1) :

pE [1 (Xi) 3] y pE [3 (Xj) 2]

ii) construcción de los plásmidos de destino (pDGB) de nivel α definidos en las reivindicaciones 3 y 4:

pDGB (A12C) (CECT 7900) y pDGB (C12B) (CECT 7899)

iii) digestión enzimática de los plásmidos de entrada obtenidos en i) y los plásmidos de destino obtenidos en ii) en presencia de E1, generando en sus extremos 3´ y 5´ secuencias terminales de cadena sencilla de DNA de al menos 3 nucleótidos,

iv) ligación con ligasa T4 entre las secuencias terminales de cadena sencilla de los plásmidos de entrada y de destino digeridos en iii) formando los plásmidos ensamblados de nivel α de DNA de doble cadena circular cerrado:

pE [1 (Xi) 3] + pE [3 (Xj) 2] + pDGB (A12C) (CECT 7900) = pE [A (Xi+Xj) C]

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pE [1 (Xi) 3] + pE [3 (Xj) 2] + pDGB (C12B) (CECT 7899) = pE [C (Xi+Xj) B];

y donde el nivel Ω comprende las siguientes etapas:

v) construcción de los plásmidos de entrada (pE) de nivel Ω cada plásmido de entrada (pE) de nivel Ω comprende una pieza de DNA de doble cadena seleccionada entre (Xi) y/o (Xj) , flanqueada en sus extremos 5´y 3´ por sendos sitios de corte y reconocimiento seleccionados entre A, B y C, para una segunda enzima de restricción de tipo IIS (E2) :

pE [A (Xi) C] y pE [C (Xj) B]

vi) construcción de los plásmidos de destino (pDGB) de nivel Ω definidos en las reivindicaciones 5 y 6:

pDGB (1AB3) (CECT 7902) y pDGB (3AB2) (CECT 7901)

vii) digestión enzimática de los plásmidos de entrada obtenidos en v) y los plásmidos de destino obtenidos en vi) en presencia de E2, generando en sus extremos 3´ y 5´ secuencias terminales de cadena sencilla de DNA de al menos 3 nucleótidos,

viii) ligación con ligasa T4 entre las secuencias terminales de cadena sencilla de los plásmidos de entrada y de destino digeridos en vii) formando los plásmidos ensamblados de nivel A de DNA de doble cadena circular cerrado:

pE [A (Xi) C] + pE [C (Xj) B] + pDGB (1AB3) (CECT 7902) = pE [1 (Xi+Xj) 3]

pE [A (Xi) C] + pE [C (Xj) B] + pDGB (3AB2) (CECT 7901) = pE [3 (Xi+Xj) 2];

cuando el método de ensamblaje se inicia en el nivel α y continua con el nivel Ω, los plásmidos de entrada de nivel A pE [A (Xi) C] y pE [C (Xj) B] definidos en v) son sustituidos por los plásmidos ensamblados de nivel 1 pE [A (Xj+Xj) C] y pE [C (Xi+Xj) B] obtenidos en iv) ; y

cuando el método de ensamblaje se inicia en el nivel Ω y continua con el nivel α, los plásmidos de entrada de nivel α pE [1 (Xi) 3] y pE [3 (Xj) 2] definidos en i) son sustituidos por los plásmidos ensamblados de nivel Ω pE [1 (Xi+Xj) 3] y pE [3 (Xi+Xj) 2] obtenidos en viii) .

8. El método de ensamblaje in vitro de piezas de DNA de doble cadena según la reivindicación 7 caracterizado porque (Xi) y/o (Xj) se selecciona entre un promotor, una secuencia de localización subcelular, una secuencia codificante, una copia de DNA se secuencia de RNA interferente, y una secuencia de terminación, un casete de expresión de proteínas, enzimas, factores de transcripción, marcadores, anticuerpos, proteínas reguladoras, o un casete de expresión de RNAs funcionales o elementos estructurales de cromatina.

9. El método de ensamblaje in vitro de piezas de DNA de doble cadena según la reivindicación 7 caracterizado porque los plásmidos de destino (pDGB) son plásmidos binarios para la transformación genética de plantas mediada por Agrobacterium tumefaciens.

10. El método de ensamblaje in vitro de piezas de DNA de doble cadena según la reivindicación 7 caracterizado porque (Xi+Xj) está formado por un gen de kanamicina, un gen que codifica para la cadena ligera de un anticuerpo y un gen que codifica para la cadena pesada de un anticuerpo.

11. El método de ensamblaje in vitro de piezas de DNA de doble cadena según la reivindicación 7 caracterizado porque (Xi+Xj) está formado por cuatro casetes de expresión constitutiva de tres genes que codifican tres proteínas fluorescentes y un cuarto gen que codifica la proteína p19.

12. Una planta transformada mediante Agrobacterium tumefaciens mediante el método de ensamblaje descrito en la reivindicación 11 y caracterizada porque dicha planta expresa un anticuerpo recombinante de tipo IgA.

13. Una planta transformada transitoriamente mediante Agrobacterium tu mefaciens mediante el método de ensamblaje descrito en la reivindicación 12 y caracterizada p orque dicha planta expresa simultáneamente las citadas tres proteínas fluorescentes.

FIGURA 1

FIGURA 2

(A)

E2

E2 (C) E1

(B)

E1E2 E1

E2 (E) E2

(D)

E2 E1 E2 E1

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FIGURA 3

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FIGURA 4

FIGURA 5

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FIGURA 6

FIGURA 7

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FIGURA 8