Promotores quiméricos capaces de mediar en la expresión génica en plantas tras una infección por patógenos y usos de los mismos.

Un promotor quimérico capaz de mediar en la expresión génica local de plantas tras una infección por patógenos que comprende

(i) al menos un elemento que actúa en cis lo suficiente para dirigir una expresión específica del inductor que comprende la secuencia de nucleótidos de las SEC ID Nº:

3 o 4

(ii) al menos un elemento que actúa en cis lo suficiente para dirigir una expresión específica del inductor que comprende la secuencia de nucleótidos de una cualquiera de las SEC ID Nº: 3 a 16, y

(iii) un promotor mínimo.

Promotores quiméricos capaces de mediar en la expresión génica en plantas tras una infección por patógenos y usos de los mismos.

La presente invención se refiere a promotores sintéticos capaces de mediar en la expresión génica en plantas tras una infección por patógenos. La presente invención se refiere también a genes y vectores recombinantes que comprenden dichos promotores quiméricos así como a las células hospedadoras transformadas con dichos promotores quiméricos, genes o vectores recombinantes. La presente invención se refiere adicionalmente a composiciones de diagnósticos y kits que comprenden promotores quiméricos, genes recombinantes, vectores o células.

La presente invención se refiere también a procedimientos para la identificación de compuestos que son capaces de activar o inhibir genes que se expresan específicamente en plantas tras una infección por patógenos empleando los medios anteriormente descritos. Además, la presente invención se refiere a células de plantas transgénicas, tejido vegetal y plantas que contienen los promotores quiméricos, genes y vectores recombinantes, vectores y/o compuestos quiméricos anteriormente mencionados identificados mediante el procedimiento de la invención en células de plantas y cultivos de tejidos, reproducción de plantas y/o agricultura.

El diseño de la resistencia a la enfermedad en las cosechas es una preocupación importante de la biotecnología vegetal. Uno de los enfoques más prometedores a este problema es diseñar reacciones defensivas que estén estrechamente relacionadas con los mecanismos de defensa natural tales como la muerte de células hipersensibles en los sitios de infección, donde las células que rodean las proximidades de un sitio de infección mueren con el fin de evitar la diseminación adicional del patógeno (Strittmatter, Bio/Technology 13 (1995) , 1085-1089) . La generación controlada de lesiones necróticas muy localizadas depende, sin embargo, de la restricción de cualquier actividad citotóxica en los sitios de infección. Esto requiere por tanto promotores que sean rápida y localmente sensibles al ataque patógeno pero que también muestren una actividad insignificante en tejidos no infectados.

Los intentos iniciales que utilizaron fragmentos grandes de promotores de genes relacionados con la patogénesis tales como prp1-1 han padecido la desventaja de que es difícil aislar un promotor que sea totalmente específico del patógeno sin actividad sustancial en tejido no infectado (Strittmatter, 1995) . Parece probable, por tanto que muy pocos promotores que se producen naturalmente, si acaso existe alguno, sean adecuados para este objetivo.

Recientes avances en el estudio detallado de los genes relacionados con la defensa han identificado numerosos elementos reguladores del ADN que actúan en cis funcionalmente definidos en promotores inducibles patógenos (Korfhage, The Plant Cell 6 (1994) , 695-708, Raventos, Plant J. 7 (1995) , 147-155, Rushton, EMBO J. 15 (1996) , 5690-5700) . Se han definido numerosos elementos que actúan en cis que son necesarios para la respuesta a los patógenos. Entre estos se incluyen las Secuencias P y L de los genes PAL del perejil (Logemann, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 92 (1995) , 5905-5909) , las Secuencias H y G de los genes PAL y 4CL de la soja (Loake, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89 (1992) , 9230-9234, junto con numerosos elementos menos bien definidos. Sin embargo, aunque se han mostrado numerosos elementos actuantes en cis que son necesarios para estimular la inducibilidad, no se sabe si estos elementos son suficientes para dirigir la expresión inducida por patógenos en células vegetales y en las propias plantas. Recientemente, se ha demostrado que, únicamente en la Secuencia W1 del perejil (Rushton, EMBO J. 15 (1996) 5690-5700, y en la secuencia ERE del maíz Prms (Raventos, Plant J (1995) , 147-155) , son suficientes únicamente cuatro copias de estos elementos para dirigir el inductor de una expresión sensible en alguna extensión en los ensayos de la expresión transitoria del gen. Sin embargo, la inducibilidad y el nivel de expresión de las construcciones investigadas en Rushton, 1996 y Raventos, 1995 varió mucho y se observó como máximo en el mejor de los casos una inducción de aproximadamente 10 veces de la expresión del gen indicador puede no ser suficiente para suministrar las necesidades biotecnológicas anteriormente descritas. De acuerdo con esto, está poco claro si estos o cualesquiera otros elementos que actúan en cis pueden ser útiles para suprimir o conferir específicamente la expresión génica local en plantas tras la infección del patógeno.

El documento WO95/03690 da a conocer elementos promotores sensibles a patógenos del promotor HMG2 y promotores quiméricos con estos elementos. El documento WO96/36697 da a conocer un promotor quimérico que comprende elementos reguladores del promotor EAS4 que permiten la expresión génica mediada por patógenos. El documento WO98/03536 identifica elementos promotores del promotor PR-1 que son responsables de la inducibilidad del promotor y del promotor quimérico que comprenden estos elementos. El documento WO96/28561 da a conocer secuencias del promotor prp-1 que son responsables de la expresión génica mediada por la infección con hongos.

De esta manera, el problema técnico de la presente invención es proporcionar promotores que sean rápida y localmente sensibles al ataque patógeno pero que muestren actividad insignificante en partes no infectadas de la planta y que se puedan usar para diseñar cultivos resistentes a la enfermedad.

La solución a este problema técnico se consigue proporcionando las realizaciones caracterizadas en las reivindicaciones.

De acuerdo con esto, la invención se refiere a un promotor quimérico capaz de mediar en la expresión génica local en plantas tras una infección por patógenos que comprende

(i) al menos un elemento que actúa en cis lo suficiente para dirigir la expresión específica del inductor que comprende la secuencia de nucleótidos de las SEC ID Nº : 3 o 4

(ii) al menos un elemento que actúa en cis lo suficiente para dirigir la expresión específica del inductor que comprende la secuencia de nucleótidos de una cualquiera de las SEC ID Nº : 3 a 16, y

(iii) un promotor mínimo.

El término "capaz de mediar en la expresión génica local en plantas tras una infección por patógenos" tal como se usa en la presente memoria descriptiva significa que dicho promotor es capaz de controlar la expresión de una secuencia de ADN heteróloga en los sitios de infección, de manera análoga o estrechamente relacionada con la expresión controlada de genes relacionados con patógenos que están implicados en la resistencia natural en las interacciones de hospedador/patógeno más incompatibles, tales como la muerte de células hipersensibles en los sitios de infección de una parte de una planta. De esta manera, el promotor quimérico de la invención se caracteriza por su capacidad de mediar en la activación transcripcional localizada selectivamente en respuesta al ataque de un patógeno o en el respuesta a inductores que imitan el ataque de un patógeno tales como el inductores preparados por ejemplo, a partir de patógenos tales como hongos o bacterias o derivados de los mismos. La activación transcripcional mediante el promotor quimérico de la invención se puede producir también en células que rodean el sitio de infección real debido a las interacciones célula-célula. El promotor quimérico de la invención puede ventajosamente no ser inducible o ser inducible solo en una pequeña extensión tras otros inductores tales cono estrés abiótico. Preferiblemente, la inducción del promotor quimérico tras el ataque de un patógeno o el tratamiento estimulante es al menos aproximadamente 10 veces mayor, preferiblemente 20 veces mayor y particularmente 30 veces mayor que su activación, si es que se produce, debida al estrés abiótico.

Sin embargo la especificidad de expresión conferida por los promotores quiméricos de la invención puede no limitarse a la expresión génica local debida a patógenos, por ejemplo, se puede combinar con secuencias reguladoras adicionales que proporcionan la expresión génica específica de tejido. El modelo de expresión particular puede depender también del sistema planta/vector empleado. Sin embargo, la expresión de las secuencias de ADN heterólogo impulsadas por las promotores quiméricos de la invención se produce predominantemente tras la infección de un patógeno o el tratamiento correspondiente con un inductor a no ser que el técnico experto tome... [Seguir leyendo]

1. Un promotor quimérico capaz de mediar en la expresión génica local de plantas tras una infección por patógenos que comprende

(i) al menos un elemento que actúa en cis lo suficiente para dirigir una expresión específica del inductor que comprende la secuencia de nucleótidos de las SEC ID Nº : 3 o 4

(ii) al menos un elemento que actúa en cis lo suficiente para dirigir una expresión específica del inductor que comprende la secuencia de nucleótidos de una cualquiera de las SEC ID Nº : 3 a 16, y

(iii) un promotor mínimo.

2. El promotor quimérico de la reivindicación 1, en el que una región separadora compuesta de 4 a 10 pares de bases separa al menos dos de los elementos que actúan en cis.

3. El promotor quimérico de la reivindicación 1 o 2 que comprende además un elemento que actúa en cis que tiene la secuencia de nucleótidos de las SEC ID Nº : 1 o 2.

4. El promotor quimérico de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, comprendiendo dicho promotor quimérico de plantas formas homo- y/o heteromultiméricas de dicho (s) elemento (s) que actúa (n) en cis (s) .

5. El promotor quimérico de la reivindicación 4, en el que dicha forma multimérica es un dímero o tetrámero.

6. El promotor quimérico de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5, en el que el promotor mínimo procede del promotor CaMV35S, del promotor CHS, del promotor PR1 o del promotor hcbt2.

7. El promotor quimérico de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 6, en el que la distancia entre dicho elemento que actúa en cis y dicho promotor mínimo es de 12 a 300 pares de bases, más preferiblemente de 25 a 70 pares de bases, y lo más preferiblemente de 40 a 60 pares de bases.

8. El promotor quimérico de una cualquiera de las reivindicaciones 4 a 7, en el que al menos dos de dichas formas multiméricas están separadas por un separador de entre aproximadamente 50 y 1000 pares de bases.

9. El promotor quimérico de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 8, en el que la inducción de la expresión génica tras el tratamiento con el inductor o la infección por patógenos es al menos de 15 veces.

10. Un gen recombinante que comprende el promotor quimérico de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 9.

11. El gen recombinante de la reivindicación 10, en el que el promotor quimérico está unido de manera operativa a una secuencia de ADN heterólogo.

12. El gen recombinante de la reivindicación 10 o 11, en el que al menos uno de dichos elementos que actúan en cis está ubicado en la región 5' o 3' no traducida o en un intrón del gen recombinante.

13. El gen recombinante de la reivindicación 11 o 12, en el que dicha secuencia de ADN heterólogo codifica un (poli) péptido, proteína citotóxica, anticuerpo, ARN antisentido, ARN de sentido directo, ribozima, factor de transcripción, proteasa, nucleasa, lipasa, o polimerasa.

14. Un vector que comprende el promotor quimérico de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 9 o el gen recombinante de una cualquiera de las reivindicaciones 10 a 13.

15. Un procedimiento para producir plantas transgénicas, células vegetales o tejido vegetal que comprende la introducción de un promotor quimérico de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 9, un gen recombinante de una cualquiera de las reivindicaciones 10 a 13 o el vector de la reivindicación 14 en el genoma de dicha planta, célula vegetal o tejido.

16. Células vegetales que comprenden un promotor quimérico de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 9, el gen recombinante de una cualquiera de las reivindicaciones 10 a 13 o el vector de la reivindicación 14 o que se puedan obtener mediante el procedimiento de la reivindicación 15.

17. Una planta o tejido vegetal transgénico que comprende células vegetales de la reivindicación 16.

18. La planta transgénica de la reivindicación 17, que en presencia del promotor quimérico o el gen recombinante ha conseguido resistencia o ha mejorado la resistencia contra un patógeno al que es susceptible la planta natural correspondiente.

19. Partes cosechables de una planta transgénica de la reivindicación 17 o 18 que comprende células vegetales de la reivindicación 16.

20. Material de propagación de una planta transgénica de la reivindicación 17 o 18 que comprende células vegetales de la reivindicación 16.

21. Una combinación de elementos que actúan en cis como se han definido en una cualquiera de la reivindicaciones 1-3 o una forma multimérica de uno cualquiera de los definidos de las reivindicaciones 1-3.

22. Un procedimiento para identificar un activador o inhibidor de genes expresados específicamente en plantas tras una infección por patógenos que comprende las etapas de:

(a) proporcionar una planta, célula vegetal, o tejido vegetal que comprende una molécula de ADN recombinante que comprende un sistema de lectura unido operativamente al promotor quimérico de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 9;

(b) cultivar dicha célula o tejido vegetal o mantener dicha planta en presencia de un compuesto o de una muestra que comprende una pluralidad de compuestos en condiciones que permitan la expresión de dicho sistema de lectura;

(c) identificar o verificar una muestra y un compuesto, respectivamente, que conduzca a la supresión o activación y/o potenciación de la expresión de dicho sistema de lectura en dicha planta, célula vegetal, o tejido vegetal.

23. El procedimiento de la reivindicación 22 que comprende además la etapa de:

(d) subdividir las muestras identificadas en la etapa (c) y repetir las etapas (a) a (c) una o más veces.

24. El procedimiento de la reivindicación 22 o 23 que comprende además la etapa de:

(e) identificar y/o aislar a partir de la muestra identificada el compuesto responsable de dicha supresión o activación y/o potenciación de la expresión de dicho sistema de lectura en dicha planta, célula vegetal, o tejido vegetal.

25. El procedimiento de una cualquiera de la reivindicaciones 22 a 24, en el que

(a) dicha molécula de ADN recombinante es un gen recombinante de una cualquiera de las reivindicaciones 10 a 13 o un vector de la reivindicación 14;

(b) dicha célula vegetal es una célula vegetal de la reivindicación 16;

(c) dicho tejido vegetal es un tejido vegetal de la reivindicación 17, o

(d) dicha planta es una planta de la reivindicación 17 o 18.

26. Una composición de diagnóstico que comprende un promotor quimérico de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 9, el gen recombinante de una cualquiera de las reivindicaciones 10 a 13, o el vector de la reivindicación 14, y opcionalmente medios de detección adecuados.

27. Un kit que comprende un promotor quimérico de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 9, el gen recombinante de una cualquiera de las reivindicaciones 10 a 13, o el vector de la reivindicación 14.

28. Uso del elemento que actúa en cis de la reivindicación 21, un promotor quimérico de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 9, el gen recombinante de una cualquiera de las reivindicaciones 10 a 13 y/o el vector de la reivindicación 14 para la producción de plantas resistentes a patógenos.

29. Uso del elemento que actúa en cis de la reivindicación 21, el promotor quimérico de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 9, un gen recombinante de una cualquiera de las reivindicaciones 10 a 13, un vector de la reivindicación 14, la célula vegetal de la reivindicación 16, el tejido vegetal de la reivindicación 17, o la planta de la reivindicación 17 o 18 para identificar y/o producir compuestos capaces de conferir resistencia inducida a un patógeno en una planta.

30. Un procedimiento para conseguir que un gen responda a patógenos que comprende insertar el elemento que actúa en cis de la reivindicación 21 en el promotor de dicho gen.

31. Un procedimiento para preparar un promotor capaz de mediar en la expresión génica local en plantas tras una infección por patógenos que comprende unir operativamente el elemento que actúa en cis de la reivindicación 21 a una secuencia de inicio de la transcripción de un promotor.

32. El procedimiento de una cualquiera de las reivindicaciones 30 a 31, que comprende además eliminar los elementos que actúan en cis no específicos del promotor.

33. El promotor que se puede obtener de acuerdo con el procedimiento de una cualquiera de las reivindicaciones 31 a 32.

Enzimas que cortan :

Enzimas que no cortan :