Un método para producir Proteína A vegetal, que es una proteína exenta de contaminación por productos de origen animal y que tiene una actividad de Proteína A vegetal,

comprendiendo el método:

fermentar una cepa secretora de Staphylococcus aureus (S. aureus) en un medio que contiene extracto de levadura, aminoácidos, péptidos de soja, glucosa y sales esenciales, estando dicho medio exento de productos animales, para producir un medio que contiene Proteína A vegetal;

recoger el medio que contiene la Proteína A vegetal; y

purificar la Proteína A vegetal a través de las siguientes etapas:

i) aplicar el medio que contiene la Proteína A vegetal a una columna de resina y eluir la Proteína A vegetal desde la columna de resina, en donde dicha resina sintética es una resina para cromatografía de intercambio aniónico,

ii) diafiltrar el eluyente de Proteína A vegetal de la columna cromatográfica de intercambio aniónico para reducir la conductividad de la solución a un máximo de 2 mS/cm, seguido de

iii) poner en contacto con una columna cromatográfica con hidroxiapatita cerámica y eluir la Proteína A vegetal desde la columna.

Producción y purificación de la Proteína A sin emplear componentes de origen animal

Antecedentes de la invención

La Proteína A es una proteína de la pared celular producida por Staphylococcus aureus. La utilidad de la Proteína A se debe a su capacidad para unirse a la región Fc de la mayoría de las inmunoglobulinas G (IgG) de mamífero y, en menor medida, a las inmunoglobulinas M (IgM) que tienen una región VH3, sin afectar a la afinidad de la inmunoglobulina hacia el antígeno. La Proteína A se usa comercialmente para purificar anticuerpos monoclonales que, a su vez, se emplean frecuentemente como agentes terapéuticos en enfermedades humanas, tales como las enfermedades inflamatorias y el cáncer. Además, la Proteína A se puede utilizar ella misma como agente terapéutico. La Proteína A se puede administrar a un paciente para que se una a los complejos inmunes circulantes en enfermedades autoinmunes, tales como artritis reumatoide, o para estimular la producción de citocinas específicas en un individuo con una infección. Además, cuando se acopla a una resina cromatográfica, la Proteína A puede actuar como un amortiguador terapéutico para el tratamiento del plasma o de la sangre entera, mediante la eliminación de los complejos de IgG en trastornos tales como la enfermedad autoinmune y el rechazo de trasplantes de órganos.

Originalmente, la Proteína A se obtenía a partir de la pared celular de S. aureus, pero se han aislado cepas bacterianas que secretan la proteína y se utilizan también para obtener la Proteína A. Sin embargo, la preparación de la Proteína A por métodos convencionales presenta un problema para su uso en la terapéutica humana. S. aureus se cultiva en un medio que contiene productos de origen animal como fuente de aminoácidos para las bacterias. En particular, se utilizan comúnmente hidrolizados y extractos bovinos como suplementos en los medios de crecimiento bacteriano. Por lo tanto, la obtención de la Proteína A partir de medios de cultivo que contienen productos obtenidos a partir de animales puede suponer que productos de origen animal, tales como priones, el agente causante de las vacas locas, la tembladera y la enfermedad degenerativa, pudieran estar presentes en los medios y se transmiten a pacientes humanos. Las preparaciones de Proteína A también se pueden exponer y estar contaminadas con productos de origen animal durante los procesos de purificación posteriores. Por ejemplo, en los métodos utilizados actualmente, la Proteína A se purifica mediante una cromatografía en columna de IgG Sefarosa y la IgG acoplada a la columna cromatográfica de Sefarosa es típicamente de origen animal. Sin embargo, los productos de origen animal que llegan a estar asociados con una preparación de Proteína A durante los procesos de aislamiento y purificación no se purifican fácilmente a partir de la preparación por los métodos conocidos actualmente.

Sumario de la invención

Características esenciales y opcionales de la presente invención se describen en las reivindicaciones principales y en las reivindicaciones subordinas acompañantes, respectivamente. Por tanto, la presente invención se refiere a un método para producir Proteína A vegetal exenta de contaminación por productos de origen animal, fermentando una cepa de S. aureus secretora en un medio específico que contiene aminoácidos o péptidos vegetales en lugar de péptidos de origen animal, recogiendo el medio que contiene la Proteína A y purificando la Proteína A mediante su aplicación a una resina sintética que carece de péptidos de origen animal y filtrando el eluyente procedente de la resina.

En una realización del método, la cepa de S. aureus secretora es Staph aureus, var Imre (S. Imre) . La Proteína A vegetal se purifica a partir del medio utilizando una resina cromatográfica de intercambio aniónico. La Proteína A vegetal se eluida de la resina cromatográfica se purifica adicionalmente por cromatografía en hidroxiapatita para eliminar los contaminantes no proteicos. Después de la purificación, la Proteína A vegetal se puede concentrar y llevarla a pH fisiológico.

El método de la presente invención hace uso de un medio vegetal para la fermentación de S. aureus que consiste en extracto de levadura, aminoácidos y péptidos vegetales, glucosa y sales esenciales. Los péptidos vegetales son péptidos de soja. Por ello, la invención se refiere a métodos para producir una Proteína A vegetal, es decir, una preparación de Proteína A exenta de contaminación con productos de origen animal, haciendo crecer las bacterias en el medio vegetal.

La composición farmacéutica puede contener una Proteína A vegetal producida por el método de la invención y un vehículo adecuado. La composición farmacéutica se puede utilizar en un método terapéutico para el tratamiento de un paciente con necesidad de ello. En particular, la composición farmacéutica se puede utilizar en un método para tratar un paciente que requiera una estimulación de la producción de citocinas o crioglobulinas mediante la administración de la composición farmacéutica de Proteína A vegetal al paciente.

La Proteína A vegetal se puede inmovilizar sobre una resina cromatográfica para formar una Proteína A vegetalresina cromatográfica. La Proteína A vegetal-resina cromatográfica se puede utilizar en un método para unir anticuerpos o fragmentos de anticuerpos. La Proteína A vegetal-resina cromatográfica se puede utilizar para purificar anticuerpos. Las composiciones farmacéuticas pueden comprender los anticuerpos purificados y un vehículo adecuado. La composición farmacéutica de los anticuerpos purificados se puede utilizar para tratar un paciente que lo requiera y, en particular, los anticuerpos se utilizan para tratar un paciente que tiene cáncer.

Una composición farmacéutica que comprende la Proteína A vegetal-resina cromatográfica y un vehículo adecuado se puede utilizar para el tratamiento de un paciente que lo requiera, en particular, la composición farmacéutica se puede utilizar para tratar la hemofilia adquirida o para tratar enfermedades autoinmunes o problemas relacionados con la inmunidad, o para tratar las enfermedades autoinmunes, artritis reumatoide o cardiomiopatía dilatada, o para tratar el problema inmune relacionado con la enfermedad de injerto contra hospedador.

Por tanto, la invención proporciona un método para producir Proteína A en una forma que evita su contaminación con proteínas de origen animal. Permite ventajosamente el suministro de una preparación de Proteína A y de composiciones farmacéuticas de Proteína A que no hayan estado en contacto con productos de origen animal, asegurando que la Proteína A no está contaminado por ellos. Esto es especialmente importante para el uso de la Proteína A en terapéutica humana.

Breve descripción de los dibujos

La Fig. 1 es un gel de SDS-PAGE que ilustra las fracciones obtenidas a partir de Proteína A vegetal eluida a partir de una columna de intercambio aniónico MacroPrep High Q.

La Fig. 2 es un análisis de un perfil lineal de un gel SDS-PAGE de la fracción 6 de la Proteína A vegetal eluida a partir de una columna de intercambio aniónico MacroPrep High Q.

La Fig. 3 es una transferencia Western que ilustra la actividad de la Proteína A vegetal purificada por cromatografía de intercambio aniónico MacroPrep High Q, comparada con la de una preparación de Proteína A convencional (Fresenius SpA) .

La Fig. 4 es un gel SDS-PAGE que ilustra las fracciones procedentes de la Proteína A vegetal eluida a partir de una columna de hidroxiapatita cerámica.

La Fig. 5 es un análisis lineal de un gel SDS-PAGE de una transferencia Western que cubre el contenido del perfil de la Proteína A de cada banda de 2 eluciones paralelas de la fracción 3 de la Proteína A vegetal eluida a partir de una columna de hidroxiapatita cerámica.

Descripción detallada de la invención

A continuación sigue una descripción de las realizaciones preferidas de la invención. La Proteína A se puede obtener a partir de cualquier cepa productora de Proteína A de S. aureus, incluyendo las cepas que son de origen natural, que se han aislado o producido por ingeniería genética. Las cepas productoras de Proteína A de S. aureus también pueden incluir las cepas en las que la Proteína A permanece encajada en la pared celular y las cepas que secretan Proteína A en el medio de crecimiento, preferiblemente S. aureus, var Imre, por ejemplo. Los... [Seguir leyendo]

1. Un método para producir Proteína A vegetal, que es una proteína exenta de contaminación por productos de origen animal y que tiene una actividad de Proteína A vegetal, comprendiendo el método:

fermentar una cepa secretora de Staphylococcus aureus (S. aureus) en un medio que contiene extracto de levadura, aminoácidos, péptidos de soja, glucosa y sales esenciales, estando dicho medio exento de productos animales, para producir un medio que contiene Proteína A vegetal;

recoger el medio que contiene la Proteína A vegetal; y

purificar la Proteína A vegetal a través de las siguientes etapas:

i) aplicar el medio que contiene la Proteína A vegetal a una columna de resina y eluir la Proteína A vegetal desde la columna de resina, en donde dicha resina sintética es una resina para cromatografía de intercambio aniónico,

ii) diafiltrar el eluyente de Proteína A vegetal de la columna cromatográfica de intercambio aniónico para reducir la conductividad de la solución a un máximo de 2 mS/cm, seguido de

iii) poner en contacto con una columna cromatográfica con hidroxiapatita cerámica y eluir la Proteína A vegetal desde la columna.

2. El método de acuerdo con la reivindicación 1, en donde:

(a) el S. aureus es la cepa secretora Staph Imre; y/o

(b) la estirpe de S. aureus utilizada para inocular el fermentador se mantiene en un medio vegetal; y/o

(c) los S. aureus se fermentan durante 10 a 24 horas; y en tal caso, opcionalmente, S. aureus se fermentan durante 13 a 14 horas; y/o

(d) el pH del medio que contiene la Proteína A vegetal se ajusta a aproximadamente 7, 5 hasta 8, 5 y la conductividad se ajusta a menos de 2 milisiemens/centímetro por diafiltración utilizando hidroximetil amino metano 10 milimolar y NaCl; y/o

(e) la cromatografía se realiza con un caudal lineal de 5, 7 a 7, 9 centímetros/minuto en una columna de 24 centímetros de altura.

3. El método de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones precedentes, en donde la Proteína A vegetal eluye como un eluyente de Proteína A vegetal a partir de la columna cromatográfica de intercambio aniónico en la etapa i) utilizando al menos Tris HCl 20 milimolar y NaCl con una conductividad de 8 milisiemens/centímetro.

4. El método de acuerdo con la reivindicación 3:

(a) en donde el pH del eluyente de Proteína A vegetal se ajusta a pH 6, 5 a 7, 1 en la etapa (ii) mediante diafiltración con fosfato sódico 14 milimolar a pH 6, 8; y/o

(b) el eluyente de Proteína A vegetal se diafiltra utilizando una membrana que tiene un peso molecular límite de 10.000 para formar un eluyente de Proteína A vegetal; y/o

(c) que comprende además la concentración del eluyente de Proteína A vegetal hasta aproximadamente 5 a 20 miligramos/mililitro utilizando un filtro para peso molecular de 10.000 y ajustar el eluyente de Proteína A vegetal a un pH neutro; y/o

(d) en donde el pH del eluyente de Proteína A vegetal se ajusta a pH neutro usando un tampón de fosfato; y/o

(e) en donde el filtrado de Proteína A vegetal aplicado a la columna de cromatografía con hidroxiapatita se lava con fosfato de sodio 14 milimolar a pH 6, 8 y se eluye con fosfato sódico 370 mM a pH 6, 8; y en tal caso además opcionalmente, la altura del lecho de resina en la columna cromatográfica de hidroxiapatita es de 20 centímetros; y/o

(f) que comprende además la concentración del eluyente de Proteína A vegetal eluido desde la columna cromatográfica de hidroxiapatita hasta 5 a 20 miligramos/mililitro, utilizando un filtro para un peso molecular de 10.000 y ajustar el eluyente de Proteína A vegetal a un pH neutro; y/o

(g) el pH del eluyente de Proteína A vegetal se ajusta a pH neutro utilizando un tampón fosfato.

5. El método de acuerdo con la reivindicación 1, en donde el medio de fermentación comprende péptidos de soja con una concentración de 15 gramos por litro, una concentración de extracto de levadura de 50 gramos por litro y una concentración de glucosa de 5 a 10 gramos por litro.