PRODUCCIÓN DE OLIGOSACÁRIDOS EN PLANTAS TRANSGÉNICAS.

La presente invención se refiere a un método para producir oligosacáridos, a los oligosacáridos producidos de esta manera, a plantas transgénicas y a células vegetales capaces de producir oligosacáridos y a las aplicaciones de los oligosacáridos obtenidos de esta manera. En la industria alimentaria se puede observar una tendencia creciente hacia lo light y lo bajo en calorías. En este sentido, se evita el uso de demasiada grasa y/o azúcar en los productos. Sin embargo, para poder proporcionar productos alimenticios con un sabor dulce se dispone comercialmente de un número creciente de sustitutos del azúcar. El aspartame es un ejemplo conocido de los mismos. El aspartame, sin embargo, tiene malas propiedades organolépticas. Otro tipo de sustituto de azúcar está formado por oligosacáridos. Los oligosacáridos son moléculas que consisten en dos o más monosacáridos tales como fructosa y/o glucosa. Los monosacáridos de dichos oligosacáridos están unidos unos a otros mediante enlaces ß-(2-1)- ó ß-(2-6). El número de monosacáridos en un oligosacárido se indica mediante el valor de grado de polimerización DP (del inglés Degree of Polymerisation). Un valor DP de 3 indica que el oligosacárido está constituido por tres monosacáridos. Las oligofructosas son oligosacáridos que constan totalmente de unidades de fructosa. Cuando un oligosacárido comprende también una o más unidades de glucosa, éstas estarán unidas mediante un enlace -(1-2) a una unidad de fructosa. La composición de los oligosacáridos también se designa a través de la fórmula GmFn, en donde G representa glucosa y F fructosa y en donde m es igual a 0 ó 1 y n es un número entero mayor o igual a 0. Los oligosacáridos particularmente adecuados son aquellos en los que m es igual a 1 y n es de 2 a 8, preferiblemente 2 ó 3. Los oligosacáridos difícilmente se hidrolizan en el estómago humano y en el intestino delgado, o no se hidrolizan en absoluto. De la oligofructosa se sabe que las enzimas digestivas humanas no tienen efecto sobre el enlace ß(2-1) y ß(2-6) de la molécula. Por tanto, pasan a través del estómago y del intestino delgado sin ser degradadas y absorbidas por el organismo. Sin embargo, los oligosacáridos no abandonan el cuerpo, sino que son metabolizados por la flora microbiana del intestino grueso. En este punto, además de gas, se liberan ácidos grasos volátiles que a su vez sirven como fuente de energía para la flora intestinal. Este fenómeno explica porqué los oligosacáridos tienen un valor energético para humanos menor que los azúcares libres tales como la glucosa, la fructosa y la sacarosa, que son absorbidas por el organismo. No obstante, los oligosacáridos presentan un poder edulcorante suficiente para servir como sustitutos de los azúcares. También se sabe que los oligosacáridos, particularmente la oligofructosa, tiene un efecto bifidogénico, es decir, estimulan el crecimiento de Bifidobacterias en el sistema digestivo. Las bifidobacterias protegen frente al desarrollo de bacterias patogénicas y por tanto tienen una influencia positiva sobre la salud. Adicionalmente, los oligosacáridos son fibras nutricionales. Actualmente se encuentran disponibles comercialmente diferentes oligosacáridos, que se preparan de formas diversas. Los oligosacáridos pueden prepararse mediante hidrólisis enzimática parcial de cadenas de inulina vegetal de mayor longitud. Por ejemplo, se describe un método para ello en la solicitud de patente Europea 440.074. Los oligosacáridos también pueden sintetizarse enzimáticamente. Para esta ruta de producción enzimática se hace uso de enzimas, fructosiltransferasas, que convierten la sacarosa en una mezcla de oligosacáridos, y que son aisladas a partir de diferentes microorganismos (JP-80/40193). Sin embargo, las rutas de producción conocidas tienen una serie de desventajas. En primer lugar, los métodos de producción conocidos son relativamente caros. Además de los oligosacáridos deseados, con una longitud de cadena de entre 2 y aproximadamente 7, en la mezcla producida también aparece un número comparativamente grande de azúcares libres y oligosacáridos con una longitud de cadena superior. La desventaja de muchos azúcares libres es que dan como resultado un aumento del valor energético de la mezcla. Los azúcares libres presentan, por ejemplo, un contenido energético de 17 kilojulios por gramo, mientras que el GF2 y el GF3 presentan un contenido energético de 4 a 6 kilojulios por gramo. Además, los azúcares libres provocan deterioro dental (caries). Inversamente, los oligosacáridos con una longitud de cadena demasiado grande presentan una capacidad edulcorante demasiado baja, lo que provoca que la capacidad edulcorante media de la mezcla disminuya. Al contrario que otros edulcorantes, tal como por ejemplo Aspartame, los oligosacáridos presentan buenas propiedades organolépticas. El documento WO94/14970 describe un método para obtener plantas transgénicas que muestren una estructura de fructano modificada mediante la transformación con genes de fructosiltransferasa bacterianos. El documento WO91/13076 describe un método in vitro para la producción enzimática de mezclas de oligosacáridos. 2 E95923598 17-11-2011   El objeto de la presente invención es proporcionar una ruta alternativa de producción de oligosacáridos con la que se eviten las anteriores desventajas. Para dicho fin, la invención proporciona un método para producir una mezcla de oligosacáridos que tengan una longitud de cadena de moléculas individuales que sustancialmente se encuentre entre 2 y 8, que comprenda las etapas de: a) seleccionar un gen de origen vegetal que codifique para una enzima capaz de convertir sacarosa en un oligosacárido; b) unir el gen a señales adecuadas de transcripción-iniciación y transcripción-terminación con el objetivo de proporcionar una construcción de expresión; c) transformar una célula vegetal adecuada con la construcción de expresión; d) regenerar una planta transgénica a partir de la célula vegetal transformada; e) cultivar la planta transgénica en las condiciones que permitan la expresión y la actividad de la enzima; y f) aislar los oligosacáridos de la planta transgénica, en donde el gen de las etapas a y b codifica para sacarosa-fructano 6-fructosiltransferasa (6-SFT) que tiene la secuencia de aminoácidos de la figura 4. Por lo tanto, la invención proporciona un método con el cual, mediante el uso de plantas transgénicas o de células vegetales, se puede producir una mezcla de oligosacáridos que tengan más propiedades deseadas en comparación con los oligosacáridos preparados mediante procesos industriales conocidos. La ventaja particular del método de acuerdo con la invención es que la distribución de longitudes de cadena es más estrecha, con lo cual en el producto final hay poco o ningún azúcar. La consecuencia de esto es una menor cariogenicidad y el deseado menor valor energético. También hay menos oligosacáridos con una longitud de cadena superior a 5 unidades. La ventaja de esto es que los oligosacáridos producidos de acuerdo con la invención presentan una mayor capacidad edulcorante específica. Se da que la capacidad edulcorante depende de la longitud de cadena media. Cuanto mayor es la longitud de cadena media de una mezcla, menor es la capacidad edulcorante. La ventaja de una capacidad edulcorante específica elevada es que raramente es necesario añadir edulcorantes adicionales durante el procesado del producto. Con respecto a la solubilidad se aplica una consideración similar. También se da en este caso que cuando la longitud de cadena media aumenta, la solubilidad disminuye. Las mezclas de acuerdo con la invención tienen, por tanto, una mayor solubilidad que las mezclas obtenidas mediante síntesis enzimática o hidrólisis enzimática. Además, los costes de producción se reducen considerablemente. Existen indicios de que las cadenas cortas pueden ser absorbidas mejor en el cuerpo de bacterias de Bifidus que las largas. Las mezclas de oligosacáridos producidas mediante el método de acuerdo con la invención tendrán, por tanto, un mayor efecto bifidogénico. El gen es el sacarosa-fructano-6-fructosiltransferasa (6-SFT) de cebada (Hordeum vulgare L.). Se proporcionan plantas transgénicas que expresan el 6-SFT para la producción de oligosacáridos. Para la expresión en plantas del gen de fructosiltransferasa seleccionado, se pueden añadir al gen señales de transcripción-iniciación tales como promotores, potenciadores y otros similares, para obtener la construcción de expresión deseada. Dichos promotores de expresión pueden ser específicos de un tipo celular especial o pueden ser activos en una amplia diversidad de tipos celulares. Adicionalmente, el tiempo y el sitio de expresión se pueden determinar mediante el uso de, por ejemplo, promotores específicos del desarrollo.... [Seguir leyendo]

1.- Un método para producir una mezcla de oligosacáridos que tienen una longitud de cadena de moléculas individuales que se encuentra sustancialmente entre 2 y 8, método que comprende las etapas de: a) seleccionar un gen de origen vegetal que codifique para una enzima que sea capaz de convertir sacarosa en un oligosacárido; b) unir el gen a señales de inicio de transcripción y de terminación de transcripción adecuadas, con el fin de proporcionar una construcción de expresión; c) transformar una célula vegetal adecuada con la construcción de expresión; d) regenerar una planta transgénica a partir de la célula vegetal transformada; e) cultivar la planta transgénica en condiciones que permitan la expresión y la actividad de la enzima; y f) aislar los oligosacáridos de la planta transgénica en donde el gen de las etapas a) y b) codifica para sacarosa-fructano 6-fructosiltransferasa (6-SFT), que tiene la secuencia de aminoácidos de la Figura 4. 2.- El método reivindicado en la reivindicación 1, en el que la construcción de expresión además comprende al menos una secuencia señal diana. 3.- El método reivindicado en cualquiera de las reivindicaciones precedentes, en el que la construcción de expresión además comprende al menos un potenciador. 4.- La construcción de ADN para expresar una enzima capaz de convertir sacarosa en oligosacáridos en una planta o célula vegetal, que comprende un gen que codifica para la enzima, acoplado en un marco de lectura a señales de inicio y de terminación de la transcripción específicas, en donde el gen codifica para la enzima sacarosa-fructano 6- fructosiltransferasa (6-SFT) que tiene la secuencia de aminoácidos de la Figura 4. 5.- Una célula vegetal transgénica, que comprende la construcción de ADN reivindicada en la reivindicación 4. 6.- Una planta transgénica que comprende la construcción de ADN de la reivindicación 5, que se puede obtener mediante regeneración a partir de una célula vegetal transgénica como la reivindicada en la reivindicación 5. 7.- Un tejido vegetal transgénico que comprende la construcción de ADN de la reivindicación 4, que procede de una planta como la reivindicada en la reivindicación 6 ó que se puede obtener mediante regeneración a partir de una célula vegetal transgénica como la reivindicada en la reivindicación 5. 13 E95923598 17-11-2011   14 E95923598 17-11-2011   E95923598 17-11-2011   16 E95923598 17-11-2011   17 E95923598 17-11-2011   18 E95923598 17-11-2011   19 E95923598 17-11-2011   E95923598 17-11-2011   21 E95923598 17-11-2011   22 E95923598 17-11-2011   23 E95923598 17-11-2011   24 E95923598 17-11-2011   E95923598 17-11-2011