GALACTOSIDASA CON ACTIVIDAD ALFA-GALACTOSILTRANSFERASA.

Secuencia de ADN que codifica una proteína con una secuencia de aminoácidos como la ofrecida en la SEQ ID n.º 2

PRODUCTO Y PROCEDIMIENTO

La invención se refiere a una β-galactosidasa con actividad transgalactosilante capaz de convertir la lactosa en una mezcla de oligosacáridos con uniones β y que produce inesperadamente el disacárido α1-6 galactobiosa con una unión α. En particular, se refiere a una β-galactosidasa aislada de una cepa recientemente descubierta de Bifidobacterium bifidum.

La invención se refiere en particular a secuencias de ADN que codifican la enzima β-galactosidasa aislada, a la enzima codificada por tal secuencia de ADN y a una célula hospedadora que comprende la secuencia de ADN o un vector recombinante que incorpora la secuencia de ADN. La invención también se refiere al uso de la enzima codificada por una secuencia de ADN, o de la célula hospedadora que contiene una secuencia de ADN o un vector recombinante, para producir oligosacáridos.

La bifidobacterias colonizan de forma natural el tramo intestinal inferior, un medio que tiene pocos mono- y disacáridos, ya que los azúcares los consumen preferentemente el hospedador y los microbios presentes en el tramo intestinal superior. Para sobrevivir en el tramo intestinal inferior, las bifidobacterias producen varias clases de exo-y endoglucosidasas en formas unidas a la superficie y/o extracelulares, mediante las cuales pueden utilizar diversos glúcidos.

Además de la actividad hidrolasa, algunas enzimas de las bifidobacterias muestran actividad transferásica. Esta actividad transglucosilante de las glucosidasas se utiliza mucho para la síntesis enzimática de diferentes oligosacáridos, que se ha demostrado que actúan como factores que favorecen el crecimiento de las bifidobacterias.

Se sabe que algunos miembros de las bifidobacterias producen enzimas β-galactosidásicas que intervienen en el metabolismo bacteriano de la lactosa. Møller, P. L. et al. en Appl & Envinron. Microbial. (2001), 62 (5), 2276-2283 describen el aislamiento y la caracterización de tres genes de β-galactosidasa de una cepa de Bifidobacterium bifidum. Encontraron que las tres β-galactosidasas eran capaces de catalizar la formación de galactooligosacáridos con uniones β mediante transgalactosilación.

Dumortier et al. en Carbohydrate Research 201, (1990), 115-123 describieron la formación de oligosacáridos con uniones β mediante una reacción de transgalactosilación durante la hidrólisis de la lactosa con Bifidobacterium bifidum DSM 20456. Su análisis de la estructura de la mezcla de oligosacáridos producidos demostró que los enlaces eran β(1→3), β-(1→6) y β-(1→4) entre D-galactosilos. Dumortier sugirió que los compuestos producidos por el Bifidobacterium bifidum intervienen en la adhesión de las bacterias al intestino grueso.

Se ha encontrado que una cepa de Bifidobacterium bifidum es capaz de producir una actividad enzimática galactosidasa que convierte la lactosa en una nueva mezcla de galactooligosacáridos que contiene inesperadamente hasta el 35% de los disacáridos de tipo galactobiosa (Gal (α 1-6) Gal). Se sabe que un disacárido similar, galabiosa (Gal (α 1-4) Gal) (véase Paton, J. C. y Paton A, W (1998) Clin. Microbiol. Revs, 11, 450-479; Carlsson, K. A. (1989) Ann. Reviews Biochem. 58, 309-350), es un antiadherente capaz de impedir la adhesión de toxinas, por ejemplo la toxina Shiga, y patógenos, tales como E. coli, a la pared del intestino.

Esta cepa de B. bifidum se depositó con el número de acceso NCIMB 41171 en la National Collection of Industrial & Marine Bacteria, Aberdeen, Reino Unido, el 31 de marzo de 2003. También se describe en la patente del Reino Unido n.º 2 412 380.

Ahora se ha encontrado que esta cepa de B. bifidum produce varias β-galactosidasas, una de las cuales muestra inesperadamente actividad α-galactosiltransferasa. Esta enzima produce una serie de oligosacáridos diferentes con uniones β, pero también produce la galabiosa, un disacárido con unión α.

De acuerdo con la invención, se da a conocer una secuencia de ADN que codifica una proteína con una secuencia de aminoácidos como la ofrecida en la SEQ ID n.º 2. La secuencia de ADN se ofrece en la SEQ ID n.º 1.

De acuerdo con un segundo aspecto de la invención, se da a conocer una enzima codificada por una secuencia de ADN como la definida anteriormente. Tal enzima puede comprender la secuencia de aminoácidos ofrecida en la SEQ ID n.º 2.

De acuerdo con un tercer aspecto de la invención, se da a conocer un vector recombinante, preferentemente un vector de expresión, que comprende una secuencia de ADN como la definida anteriormente. Tal vector se puede incorporar en una célula hospedadora, tal como una célula bacteriana, de levadura u de hongo. Alternativamente, la secuencia de ADN se puede incorporar en tal célula hospedadora. Se puede seleccionar una célula hospedadora adecuada entre Bifidobacterium, Lactococcus, Lactobacillus, Bacillus, por ejemplo Bacillus subtilis o Bacillus circulans, Escherichia y Aspergillus, por ejemplo Aspergillus niger.

Utilizando la lactosa como sustrato, la enzima codificada por una secuencia de ADN como la definida anteriormente produce una mezcla de disacáridos que comprende Gal (β 1-3) Glc, Gal (β 1-3) Gal, Gal (β 1-6) Gal y Gal (α 1-6) Gal. También se encuentran presentes en la mezcla de oligosacáridos los trisacáridos Gal (β 1-6) Gal (β 1-4) Glc, Gal (β 1-3) Gal (β 1-4) Glc, el tetrasacárido Gal (β 1-6) Gal (β 1-6) Gal (β 1-4) Glc y el pentasacárido Gal (β 1-6) Gal (β 1-6) Gal (β 1-6) Gal (β 1-4) Glc.

La enzima o la célula hospedadora que se han definido anteriormente se pueden utilizar para producir una mezcla de disacáridos, que incluyen Gal (α 1-6) Gal (galabiosa) que puede formar parte de un producto que mejora la salud del intestino. Tal producto se puede seleccionar entre el grupo que consiste en productos lácteos (por ejemplo, leche líquida, leche en polvo seco tal como leche en polvo entera, leche en polvo desnatada, leche en polvo reconstituida, suero en polvo, leches infantiles, fórmulas para bebés, helado, yogur, queso, productos lácteos fermentados), bebidas tales como zumo de frutas, alimentos infantiles, cereales, pan, galletas, golosinas, pasteles, complementos alimenticios, complementos dietéticos, productos comestibles simbióticos, productos comestibles prebióticos, alimentos para animales, alimentos para aves de corral o de hecho cualquier otra comida o bebida.

Alternativamente, los oligosacáridos así producidos se pueden utilizar para preparar un medicamento, por ejemplo en forma de comprimido o cápsula, para impedir la adhesión de los patógenos o de las toxinas producidas por los patógenos a la pared de intestino. El medicamento se puede administrar a un paciente, por ejemplo, después de un ciclo de tratamiento con antibióticos que a menudo altera o incluso destruye la flora normal del intestino sano.

De acuerdo con aún otro aspecto de la invención, se da a conocer un procedimiento para producir una enzima como la definida anteriormente que comprende cultivar una célula hospedadora como la definida anteriormente en un medio de cultivo adecuado en unas condiciones que permiten la expresión de la enzima y recuperar la enzima resultante del cultivo.

La invención también se dirige a un procedimiento para producir una mezcla de oligosacáridos, entre ellos el disacárido Gal (α 1-6) Gal (galabiosa), que comprende poner en contacto la enzima como la definida anteriormente o una célula hospedadora como las definidas anteriormente con un material que contiene lactosa en condiciones que conducen a la formación de la mezcla del oligosacárido.

El material adecuado que contiene la lactosa se puede seleccionar entre lactosa disponible comercialmente, leche entera, leche semidesnatada, leche desnatada, suero de leche, leche reconstituida, impregnado de suero. Tales productos lácteos se pueden obtener de vacas, búfalos, ovejas o cabras. La leche reconstituida se define como leche entera que se ha desnatado para retirar la grasa láctea, que se reemplaza posteriormente con la adición de grasa o aceite vegetal.

Breve descripción de los dibujos

La figura 1 muestra la secuencia nucleotídica (SEQ ID n.º 1) de la β-galactosidasa de Bifidobacterium bifidum de la invención; y

La figura 2 muestra la secuencia de aminoácidos (SEQ ID n.º 2) que corresponde a la... [Seguir leyendo]

1. Secuencia de ADN que codifica una proteína con una secuencia de aminoácidos como la ofrecida en la SEQ ID n.º 2.

2. Secuencia de ADN de acuerdo con la reivindicación 1, en la que la secuencia se ofrece en la SEQ ID n.º 1.

3. Enzima codificada por una secuencia de ADN según la reivindicación 1 o según la reivindicación 2.

5 4. Enzima que comprende una secuencia de aminoácidos de acuerdo con la SEQ ID n.º 2.

5. β-Galactosidasa que tiene la secuencia que se define en la SEQ ID n.º 2.

6. Vector recombinante que comprende una secuencia de ADN según la reivindicación 1 o según la reivindicación 2.

7. Vector de acuerdo con la reivindicación 6, en el que dicho vector es un vector de expresión.

8. Célula hospedadora que comprende una secuencia de ADN según la reivindicación 1 o según la reivindicación 2.

10 9. Célula hospedadora que comprende el vector según la reivindicación 6 o según la reivindicación 7.

10. Célula hospedadora de acuerdo con la reivindicación 8 o con la reivindicación 9, en la que dicha célula es una célula bacteriana, una célula de levadura o una célula de hongo.

11. Célula hospedadora de acuerdo con la reivindicación 10, en la que dicha célula se selecciona del grupo que consiste en Bifidobacterium, Lactococcus, Lactobacillus, Escherichia, Bacillus y Aspergillus.

15 12. Célula hospedadora de acuerdo con la reivindicación 11, en la que la célula se selecciona del grupo que consiste en Bifidobacterium bifidum, Bacillus subtilis, Bacillus circularis y Aspergillus niger.

13. Utilización de una enzima según una cualquiera de las reivindicaciones 3 a 5, o de una célula según una cualquiera de las reivindicaciones 8 a 12, para producir una mezcla de oligosacáridos.

14. Utilización de acuerdo con la reivindicación 13, en la que la mezcla comprende los disacáridos Gal (β 1-3) Glc, Gal 20 (β 1-3) Gal, Gal (β 1-6) Gal y Gal (α 1-6) Gal.

15. Utilización de acuerdo con la reivindicación 13 o con la reivindicación 14, en la que la mezcla comprende trisacáridos Gal (β 1-6) Gal (β 1-4) Glc, Gal (β 1-3) Gal (β 1-4) Glc, tetrasacárido Gal (β 1-6) Gal (β 1-6) Gal (β 1-4) Glc, y pentasacárido Gal (β 1-6) Gal (β 1-6) Gal (β 1-6) Gal (β 1-4) Glc.

16. Utilización de una enzima según una cualquiera de las reivindicaciones 3 a 5, o de una célula según una cualquiera

25 de las reinvindicaciones 8 a 12, para producir una mezcla de oligosacáridos que son parte de un producto seleccionado entre el grupo que consiste en productos lácteos, tales como leche líquida, leche en polvo seco, leches infantiles, fórmulas para bebés, helado, yogur, queso, productos lácteos fermentados, bebidas tales como zumo de fruta, comidas infantiles, cereales, pan, galletas, golosinas, pasteles, complementos alimenticios, complementos dietéticos, productos comestibles probióticos, productos comestibles prebióticos, comidas para animales, comidas para aves de corral y medicamentos.

17. Utilización de acuerdo con la reivindicación 16, en la que la mezcla comprende disacáridos Gal (β 1-3) Glc, Gal (β 13) Gal, Gal (β 1-6) Gal y Gal (α 1-6) Gal, trisacáridos Gal (β 1-6) Gal (β 1-4) Glc, Gal (β 1-3) Gal (β 1-4) Glc, tetrasacárido Gal (β 1-6) Gal (β 1-6) Gal (β 1-4) Glc y pentasacárido Gal (β 1-6) Gal (β 1-6) Gal (β 1-6) Gal (β 1-4) Glc.

18. Utilización de una célula hospedadora según una cualquiera de las reivindicaciones 8 a 12, para producir un

35 producto seleccionado entre el grupo que consiste en productos lácteos, tales como leche líquida, leche en polvo seco, leches infantiles, fórmulas para bebés, helado, yogur, queso, productos lácteos fermentados, bebidas tales como zumo de fruta, comidas infantiles, cereales, pan, galletas, golosinas, pasteles, complementos alimenticios, complementos dietéticos, productos comestibles probióticos, productos comestibles prebióticos, comidas para animales, comidas para aves de corral y medicamentos.

40 19. Procedimiento para producir una enzima según una cualquiera de las reivindicaciones 3 a 5, que comprende el cultivo de una célula hospedadora según una cualquiera de las reivindicaciones 10 a 14 en un medio de cultivo adecuado en condiciones que permiten la expresión de dicha enzima y la recuperación de la enzima resultante a partir del cultivo.

20. Procedimiento para producir una mezcla de oligosacáridos que comprende disacáridos Gal (β 1-3) Glc, Gal (β 1-3)

45 Gal, Gal (β 1-6) Gal y Gal (α 1-6) Gal, trisacáridos Gal (β 1-6) Gal (β 1-4) Glc, Gal (β 1-3) Gal (β 1-4) Glc, tetrasacárido Gal (β 1-6) Gal (β 1-6) Gal (β 1-4) Glc y pentasacárido Gal (β 1-6) Gal (β 1-6) Gal (β 1-6) Gal (β 1-4) Glc, comprendiendo dicho procedimiento poner en contacto una enzima según una cualquiera de las reivindicaciones 3 a 5 o una célula hospedadora según una cualquiera de las reivindicaciones 8 a 12 con un material que contiene lactosa.