PROCEDIMIENTO PARA LA PRODUCCIÓN DE PLANTAS TRANSGÉNICAS QUE PRESENTAN ALTO CONTENIDO Y RENDIMIENTO EN ALMIDÓN Y BIOMASA.

Procedimiento para la producción de plantas transgénicas que presentan alto contenido y rendimiento en almidón y biomasa. Campo de la invención La presente invención se engloba dentro del campo de la ingeniería genética y de la fisiología vegetal. Concretamente la invención comprende un procedimiento para la producción de plantas transgénicas con alto contenido y rendimiento en almidón y biomasa; así como los vectores utilizados para transformar las células, las propias células transformadas, las plantas transgénicas obtenidas por dicho procedimiento y sus respectivos usos. Estado de la técnica El glucógeno (en animales y bacterias) y el almidón (en plantas) constituyen las formas principales de almacenamiento de carbohidratos de reserva. En plantas el almidón se acumula en grandes cantidades en órganos tales como semillas y tubérculos, y es un constituyente fundamental de la dieta del ser humano. Por otro lado, el almidón constituye una fuente de material renovable y completamente biodegradable, siendo utilizado frecuentemente en las industrias papelera, cosmética, farmacéutica y alimentaria, además de emplearse como componente fundamental para la fabricación de plásticos biodegradables, pinturas de bajo impacto medioambiental y bioetanol. La biosíntesis de almidón es un proceso complejo que requiere la acción concertada de diferentes actividades enzimáticas tales como la sacarosa sintasa, la fosfoglucomutasa, la ADP-glucosa pirofosforilasa, diferentes tipos de glucosil transferasas comúnmente designadas como almidón sintasas (SS), y las enzimas ramificante y desrramificante del almidón (1). La SS en plantas y la glucógeno sintasa (GlgA) en bacterias catalizan la transferencia de la mitad glucosídica de la molécula de ADP-Glucosa (el donador activado de glucosa) a un glucano (1-4) preexistente. En todos los organismos fotosintéticos que acumulan almidón se han encontrado las mismas SSs denominadas SSI, SSII, SSIII, SSIV y GBSSI. Este alto grado de conservación indica que cada una de estas proteínas desempeña funciones diferentes en el proceso de creación del gránulo de almidón (2). Así por ejemplo, la GBSSI está implicada en la producción de amilosa, mientras que la SSI, la SSII y la SSIII están implicadas en la producción de cadenas de almidón cortas, intermedias y largas de amilopectina, respectivamente (3). La SSIV es la menos conocida de la familia de proteínas comúnmente designadas como SSs solubles. Su secuencia aminoacídica con respecto a SSI, SSII y SSIII varía entre un 30% y un 50% (4, 5). A pesar de su designación, todavía no se ha demostrado su actividad SS. Es más, recientemente se ha instalado la idea de que SSIV no cubre el campo de acción y función de las otras SSs (6). Sin embargo, existen evidencias que sugieren que SSIV puede estar implicada en la determinación del número de gránulos de almidón existentes en el plastidio (7). Son múltiples las referencias que muestran que la reducción de la actividad SSI, SSII y SSIII conlleva una reducción en los niveles de almidón y la alteración de la estructura y composición del gránulo (8, 9). Mutantes de Arabidopsis que no poseen SSIV acumulan niveles reducidos de almidón pero (a) el balance amilosa/amilopectina y la estructura molecular de la amilopectina son normales y (b) tan solo producen un gránulo de almidón por cloroplasto (7). Contrariamente a lo esperado, plantas transgénicas que sobre-expresan la GlgA de Escherichia coli acumulan bajo contenido en almidón (10). Si bien la expresión ectópica de SSI, SSII y SSIII ha sido utilizada como estrategia para incrementar el contenido en almidón (WO 00/66745) y modificar propiedades del almidón tales como el contenido en fosfato (WO2007/009823) (11-13) o el balance amilosa/amilopectina (WO 2006/084336; WO 2002/018606), no existen evidencias experimentales que indiquen que (a) SSIV tiene actividad SS y (b) la expresión ectópica de SSIV pueda ser utilizada como una estrategia biotecnológica para incrementar la cantidad del almidón, así como el rendimiento y tasa de acumulación de biomasa de las plantas. En la presente invención, tras demostrar que SSIV es una SS que reúne propiedades totalmente diferentes a las SSs solubles SSI, SSII y SSIII, se describe por primera vez que la sobre-expresión de SSIV es una estrategia biotecnológica para la producción de plantas transgénicas con altos niveles de almidón y altos rendimientos de almidón y biomasa. Descripción de la invención Breve descripción de la invención La presente invención se refiere a un procedimiento para la producción de plantas transgénicas que presentan alto contenido y rendimiento en almidón y biomasa, mediante la expresión ectópica de SSIV. Además la presente invención se refiere a las propias plantas transgénicas caracterizadas por dichas propiedades. Los efectos técnicos mostrados en la presente invención son extrapolables a cualquier tipo de órgano de la planta tal como tubérculos, hojas, frutos y semillas; así como a cualquier tipo de planta como por ejemplo: Arabidopsis, patata, tabaco, tomate, arroz, cebada, trigo y maíz. Los resultados mostrados en la presente invención fueron conse- 2 ES 2 354 897 A1 guidos, tanto expresando constitutivamente AtSSIV (el gen que codifica para SSIV en A. thaliana) bajo el control del promotor 35S, como expresando AtSSIV bajo el control de un promotor específico de tubérculo utilizado (promotor del gen de la patatina). Cabe decir que la expresión constitutiva fue particularmente preferida. Los resultados mostrados en la presente invención fueron conseguidos tras sobre-expresar cualquier isoforma y secuencia de SSIV (siendo particularmente preferida la SSIV de Arabidopsis). Es decir, cualquier promotor expresable en plantas que produzca la sobre-expresión de AtSSIV, así como cualquier isoforma de SSIV, estarían comprendidos en la presente invención. A efectos de la presente invención, se hacen constar los siguientes términos: Planta transgénica: planta cuyo genoma ha sido modificado mediante ingeniería genética con el objetivo de conseguir características biológicas diferentes y/o mejoradas respecto a las de la planta silvestre control (WT). Célula vegetal transformada: son células vegetales que presentan una alteración genética resultado de la introducción y expresión de material genético externo en su genoma. Sobre-expresión de SSIV: una planta sobre-expresa el enzima SSIV cuando la intensidad de la banda obtenida en un western blot de un extracto de una planta transformada es significativamente superior a la obtenida con un extracto de plantas WT cultivadas en las mismas condiciones y en el mismo momento. A modo ilustrativo, en la Figura 11A se puede observar que la intensidad de las bandas obtenidas a partir de extractos de plantas transgénicas de Arabidopsis y de patata que sobre-expresan AtSSIV es significativamente superior a la obtenida a partir de extractos de plantas WT en western blots en los que se utilizó un anticuerpo específico de AtSSIV. Alto contenido de almidón: según se utiliza en la presente invención, esta expresión está directamente referida a un valor estadísticamente significativo, superior a los valores observados en las plantas control. A modo ilustrativo, en la Figura 13 se puede observar que el contenido medio de almidón en los tubérculos de las plantas de patata silvestres analizadas es de aproximadamente 525 µmoles de glucosa/g de peso fresco, con un margen de variación del 10%. Por lo tanto podría considerarse como alto contenido en amidón aquel que supere, al menos en un 10%, dicho valor de 525 umoles de glucosa/g de peso fresco. En la presente invención se supera dicho valor consiguiendo tubérculos transgénicos que acumulan cantidades de almidón de 600 µmoles de glucosa/g de peso fresco como mínimo. Alta productividad en biomasa: según se utiliza en la presente invención, esta expresión está directamente referida a un valor estadísticamente significativo, superior a los valores observados en las plantas control. A modo ilustrativo, en la Figura 14 se puede observar que el incremento del peso fresco de plantas transgénicas de Arabidopsis a lo largo del desarrollo de la planta es más acelerado que en las plantas silvestres. Actividad SSIV: la actividad de la enzima SSIV comprende (a) transferir unidades de glucosa desde ADPglucosa a maltotriosa y poliglucanos tales como almidón, amilosa, amilopectina y glucógeno y (b) estar localizada en la superficie del gránulo de almidón. Breve descripción de las figuras Figura 1. Mapa de restricción del plásmido pAtSSIV resultante del clonaje de un cDNA completo que codifica para el gen AtSSIV de Arabidopsis thaliana en el vector pGEM-T easy (Promega). Figura 2. (a-h) Comparación de secuencias aminoacídicas deducidas de AtSSI, AtSSII, AtSSIII y AtSSIV. Los aminoácidos conservados... [Seguir leyendo]

1. Procedimiento para la obtención de plantas transgénicas con alto contenido y rendimiento en almidón y biomasa, caracterizado por la transformación de la planta silvestre con un vector de expresión que comprende una secuencia nucleotídica que codifica para una enzima con actividad SSIV y la expresión de dicha secuencia nucleotídica en el interior de la planta transformada. 2. Procedimiento, según la reivindicación 1, caracterizado porque el nivel de expresión de SSIV en el interior de la planta transformada es al menos 2 veces superior al nivel de expresión de SSIV de la planta silvestre. 3. Procedimiento, según la reivindicación 1, caracterizado porque la secuencia nucleotídica comprendida en el vector de expresión utilizado para transformar la planta silvestre es la SEQ ID NO: 3 que codifica para la SEQ ID NO: 4. 4. Procedimiento, según la reivindicación 1, caracterizado porque el vector de expresión utilizado para transformar la planta es Agrobacterium tumefaciens DSM 19675 que comprende el plásmido pK2GW7,0.AtSSIV. 5. Célula transformada con un vector de expresión, preferentemente un plásmido, que comprende una secuencia nucleotídica que codifica para una proteína o un fragmento proteico con actividad SSIV. 6. Célula, según la reivindicación 5, transformada con un vector de expresión seleccionado entre: Agrobacterium tumefaciens DSM 19675, plásmido pET-AtSSIV o plásmido pGEX-4T3_FragSSIV. 7. Célula vegetal, según la reivindicación 6, caracterizada por haber sido transformada con Agrobacterium tumefaciens DSM 19675 y pertenecer a cualquiera de las siguientes especies de plantas: patata (Solanum tuberosum), tabaco (Nicotiana tabacum), cebada (Hordeum vulgare), arroz (Oryza sativa), maíz (Zea mays) o arabidopsis (Arabidopsis thaliana). 8. Célula bacteriana, según la reivindicación 6, caracterizada por haber sido transformada con un plásmido bacteriano seleccionado entre: pET-AtSSIV o pGEX-4T3_FragSSIV y pertenecer a una cepa de E. coli seleccionada entre: BL21(DE3), BL21(DE3)AglgAP o BL21(DE3)AglgCAP. 9. Vector de expresión Agrobacterium tumefaciens DSM 19675 caracterizado por comprender el plásmido pK2GW7,0-AtSSIV que codifica para una enzima con actividad SSIV. 10. Plásmido pET-AtSSIV caracterizado por codificar para una enzima con actividad SSIV. 11. Plásmido pGEX-4T3_FragSSIV caracterizado por codificar para un fragmento antigénico de una enzima con actividad SSIV. 12. Uso de las células bacterianas transformadas con el plásmido pET-AtSSIV de la reivindicación 8, para la producción de una enzima con actividad SSIV. 13. Uso de las células bacterianas transformadas con el plásmido pGEX-4T3_FragSSIV de la reivindicación 8, para la producción de anticuerpos frente a un fragmento específico de una enzima con actividad SSIV. 14. Uso de la célula de la reivindicación 6 para la producción de almidón y/o biomasa. 15. Planta transgénica vascular caracterizada por estar transformada con el vector de la reivindicación 9 y por poseer alto contenido y rendimiento en almidón y biomasa, en comparación con la planta silvestre sin transformar. 16. Planta transgénica, según la reivindicación 15, caracterizada por presentar un nivel de expresión de SSIV al menos 2 veces superior al observado en la planta silvestre sin transformar. 17. Planta transgénica, según la reivindicación 15, caracterizada porque su contenido en almidón y/o biomasa es al menos un 10% superior al contenido en almidón y/o biomasa de las plantas silvestres sin transformar. 18. Planta transgénica, según la reivindicación 15, seleccionada del grupo que comprende: patata (Solanum tuberosum), tabaco (Nicotiana tabacum), cebada (Hordeum vulgare), arroz (Oryza sativa), maíz (Zea mays) o arabidopsis (Arabidopsis thaliana). 19. Uso de las plantas transgénicas de las reivindicaciones 15 a 18, para la producción de almidón y biomasa. 9 ES 2 354 897 A1 ES 2 354 897 A1 11 ES 2 354 897 A1 12 ES 2 354 897 A1 13 ES 2 354 897 A1 14 ES 2 354 897 A1 ES 2 354 897 A1 16 ES 2 354 897 A1 17 ES 2 354 897 A1 18 ES 2 354 897 A1 19 ES 2 354 897 A1 ES 2 354 897 A1 21 ES 2 354 897 A1 22 ES 2 354 897 A1 23 ES 2 354 897 A1 24 ES 2 354 897 A1 ES 2 354 897 A1 26 ES 2 354 897 A1 27 ES 2 354 897 A1 28 ES 2 354 897 A1 29 ES 2 354 897 A1 <110> IDEN BIOTECHNOLOGY ES 2 354 897 A1 LISTA DE SECUENCIAS <120> PROCEDIMIENTO PARA LA PRODUCCIÓN DE PLANTAS TRANSGÉNICAS QUE PRESENTAN ALTO CONTENIDO Y RENDIMIENTO EN ALMIDÓN Y BIOMASA <130> P-02874 <160> 6 <170> PatentIn version 3.3 <210> 1 <211> 69 <212> DNA <213> Secuencia Artificial <220> <223> Cebador ATSSIV_Directo 5-3 <400> 1 <210> 2 <211> 54 <212> DNA <213> Secuencia Artificial <220> <223> Cebador ATSSIV_Inverso 5-3 <400> 2 <210> 3 <211> 3123 <212> DNA <213> Secuencia Artificial <220> <223> AtASS4 5-3 1 <400> 3 ES 2 354 897 A1 2 ES 2 354 897 A1 3 <210> 4 <211> 1040 <212> PRT <213> Secuencia Artificial <220> <223> AtASS4 <400> 4 ES 2 354 897 A1 4 ES 2 354 897 A1 ES 2 354 897 A1 6 ES 2 354 897 A1 7 ES 2 354 897 A1 8 <210> 5 <211> 25 <212> DNA <213> Secuencia Artificial <220> <223> Oligonucleótido 5-3 <400> 5 <210> 6 <211> 18 <212> DNA <213> Secuencia Artificial <220> <223> Oligonucleótido 5-3 <400> 6 ES 2 354 897 A1 9 OFICINA ESPAÑOLA DE PATENTES Y MARCAS ESPAÑA