MUTANTES POR DELECIÓN DE GLICOSILTRANSFERASAS DE NEISSERIA PARA BIOSÍNTESIS DE OLIGOSACÁRIDOS Y GENES QUE LAS CODIFICAN.

Mutantes por deleción de glicosiltransferasas de neisseria para biosíntesis de oligosacáridos y genes que las codifican Campo de la invención La presente invención se refiere a glicosiltransferasas útiles para la biosíntesis de oligosacáridos, genes que codifican dichas glicosiltransferasas y procedimientos recombinantes de producir las enzimas y los oligosacáridos producidos de este modo. Antecedentes de la invención Neisseria y Lipooligosacárido (LOS) Aunque las especies de Neisseria colonizan habitualmente muchos huéspedes mamíferos, los seres humanos son la única especie sujeta a enfermedad invasiva por miembros de esta especie. Neisseria meningitidis es el agente etiológico de septicemia y meningitis que se pueden producir de forma epidémica. Neisseria gonorrhoeae es el agente causal de gonorrea y sus múltiples complicaciones. Estos organismos, particularmente los gonococos, tienen una notable habilidad probada para variar el conjunto antigénico de las moléculas expuestas en su superficie, principalmente sus pilosidades adhesivas y proteínas relacionadas con la opacidad (opa). Las características principales de los mecanismos genéticos para la variación de las pilosidades (Meyer y col., 1982, Cell 30:45; Haas y Meyer, 1986, Cell 44:107; Koomey y col., 1987, Genetics 117:391; Swanson y Koomey, 1989, American Society for Microbiology, Washington, 743-761) y la expresión de la proteína opa ((Stem y col., 1986, Cell 47:61; Meyer et al., 1990, Ann. Rev. Microbiol. 44:451; Bhat y col., 1991, Molec. Microbiol. 5:1889) se conocen bien. Como otras bacterias gramnegativas, las especies de Neisseria portan LPS en la cubierta externa de sus membranas externas (Johnston y Gotschlich, 1974, J. Bactetiol. 119; 250). En contraste con las moléculas de LPS de alto peso molecular con repeticiones de cadenas O que se observan en muchas bacterias entéricas, el LPS de Neisseria ssp. tiene un tamaño modesto y, por tanto, a menudo se denomina lipooligosacárido o LOS. Aunque el tamaño molecular del LOS es similar al observado en los mutantes del LPS en bruto de Salmonella ssp, esta sustancia tiene una considerable diversidad antigénica. En el caso de los meningococos se ha desarrollado un esquema de tipado serológico que separa las cepas en 12 inmunotipos (Zollinger y Mandrell, 1977, Infect. Immun. 18:424; Zollinger y Mandrell, 1980, Infect. Immun. 28:451). Mediante los estudios de Jennings y col. (Jennings y col., 1983, Carbohyd. Res. 121:233; Michon y col., 1990, J. Biol. Chem. 265:7243; Gamian y col., 1992, J. Biol. Chem. 267:922; Pavliak y col., 1993, J. Biol. Chem. 268:14146) se ha conseguido una comprensión bastante completa de la estructura del LPS de los meningococos (revisado recientemente (Verheul y col., 1993, Microbiol. Rev. 57:34). En el caso de Neisseria gonorrhoeae, la variabilidad antigénica es tan pronunciada que ha sido difícil alcanzar un esquema de clasificación serológica. En parte esto se debe a la heterogeneidad del LOS sintetizado por una cepa concreta; las preparaciones de LOS con frecuencia contienen varias bandas muy próximas mediante SDS-PAGE (Mandrell y col., 1986, Infect. Immun. 54:63). Además, los estudios con anticuerpos monoclonales indican que los gonococos pueden cambiar las características serológicos del LOS que expresa y que esta variación antigénica se produce con una frecuencia de 10 -2 a 10 -3 , lo que indica que debe existir algún mecanismo genérico para alcanzar estas variaciones de frecuencia alta (Schneider y col., 1988, Infect. Immun. 56:942: Apicella y col., 1987, Infect. lmmun. 55:1755). Dada la heterogeneidad molecular y la variación antigénica del LOS producido por los gonococos, la determinación de la química estructural de este antígeno ha sido un problema difícil y sólo recientemente se ha dispuesto de información definitiva en base a análisis muy sofisticados (Yamasaki y col., 1991, Biochemistry 30:10566; Kerwood y col., 1992, Biochemistry 31:12760; John y col., 1991, J. Biol. Chem. 266:19303; Gibson y col., 1993, J. Bacteriol. 175:2702). Estos se resumen en la Figura 1. De interés concreto es la presencia del tetrasacárido Galß14GlcNAcß13Galß14Glcß14, que es un imitador perfecto de lacto-Nneotetraosa del esfingolípido praglobósido (Mandrell y col., 1988, J. Exp. Med. 168:107; Tsai y Civin, 1991, Infect. Immun. 59: 3604). En el LOS, este tetrasacárido con frecuencia lleva un residuo de N-acetil galactosamina GalNAcß13Galß14GlcNAcß13Galß14Glcß14) adicional e imita a los gangliósidos. En algunas cepas de gonococos se encuentra una cadena lateral alternativa que tiene la estructura Gal14Galß14Glcß14HepR (John y col., 1991, J. Biol. Chem. 266:19303). Esta es un imitador de la porción sacárida de los globo-glicolípidos (Mandrell, 1992, Infect. Immun. 60:3017) y es la estructura que normalmente se encuentra en el inmunotipo L1 de Neisseria meningitidis. Las moléculas de LOS tienen una serie de actividades biológicas. Son potentes moléculas endotóxicas que se cree que son la toxina responsable de la necrosis cortical suprarrenal que se observa en la enfermedad meningocócica grave. Sirven como antígeno diana para gran parte de la actividad bactericida presente en sueros de seres humanos normales o convalecientes (Rice y col., 1980, J. Immunol. 124:2105). Los gonococos poseen una actividad sialiltransferasa muy inusual que es capaz de usar CMP-NANA suministrado externamente y añadir ácido N-acetil-neuramínico al LOS sobre la superficie del organismo (Nairn y col., 1988, J. Gen. Microbiol. 134:3295; 2   Parsons y col., 1989, Microb. Pathog. 7:63; Mandrell y col., 1990, J. Exp. Med. 171:1649). Los meningococos de los grupos B y C tienen la capacidad de sintetizar CMP-NANA y con frecuencia sialinan su LOS sin requerir CMP-NANA exógeno (Mandrell et al., 1991, J. Bacteriol. 173: 2823). En la cepa 6275 de Neisseria meningitidis, inmunotipo L3, la unidad de ácido siálico está unida en 23 al residuo Gal terminal de la lacto-N-neotetraosa (Yamasaki y col., 1993, J. Bacteriol. 175:4565). Los niveles de CMP-NANA que se encuentran en varios ambientes del huésped son suficientes para soportar esta reacción (Apicella y col., 1990, J. Infect. Dis. 162:506). La sialización del LOS hace que los gonococos sean resistentes al efecto bactericida del suero dependiente de anticuerpos-complemento (Parsons y col., 1989, Microb. Pathog. 7:63). La resistencia no sólo es frente al efecto bactericida mediado por los anticuerpos frente al LOS, sino también a otros antígenos de superficie (Wetzler y col., 1992, Infect. Immun. 60:39). van Putten ha demostrado que la exposición de los gonococos a CMP-NANA reduce marcadamente su capacidad para invadir las células epiteliales en cultivo tisular (Van Putten, 1993, EMBO J. 12:4043). Estos hallazgos sugieren con certeza que la capacidad de los gonococos para variar la naturaleza química del LOS les proporciona la capacidad de lidiar con diferentes ambientes del huésped (Mandrell y Apicella, 1993, Immunobiology 187:382). Quizá más revelador es que se ha encontrado que la variación de LOS se selecciona in vivo en infecciones de seres humanos. Una variante A MS11mk de una cepa de gonococos de laboratorio bien caracterizada se usó para inocular voluntarios (Swanson y col., 1988. J. Exp. Med. 168:2121). En los dos individuos infectados durante un periodo de 4 a 6 días, la población de gonococos recuperada en su orina se desplazó de forma creciente hacia dos variantes que expresaban LOS antigénicamente diferentes (Schneider et al, 1991.J Exp Med. 174:1601. Un análisis estructural reveló que la variante inoculada A producía un LOS truncado que sólo contenían el grupo ß-lactosilo unido a HepI, mientras que una de las nuevas variantes (variante C) producía un LOS completo (Kerwood y col., 1992, Biochemistry 31:12760). Esto sugiere que es probable que la adición de azúcares adicionales GalNAcß13Galß14GlcNAcß13 esté bajo el control de un mecanismo de variación de la fase. Se dispone de poca información sobre la genética de la síntesis de LOS en Neisseria. Un avance importante ha sido la creación (Dudas y Apicella, 1988. Infect. Immun 56:499) y la caracterización bioquímica (John y col, 1991. J. Biol. Chem. 266:19303) de cinco mutantes de piocina de la cepa de gonococos 1291. Datos inmunológicos y bioquímicos sobre dubbed 1291a-e muestran que 1291a. 1291c.1291d y 1291e producen LOS con acortamiento secuencial de la cadena de lacto-N-neotetraosa, de los que el mutante 1291e carece de la sustitución de glucosa sobre la heptosa. La mutante 1291b sintetiza la estructura alternativa del LOS Gal14Gaß14Glc (véase la Figura 1). Ahora sólo se define la base genética de la mutante 1291e. Es una mutación de fosfoglucomutasa (pgm), que impide la síntesis de UDP-glucosa y, por tanto, la adición del primer residuo de la unidad de lacto-N- neotetraosa (Zhou y col. 1994, J. Biol.... [Seguir leyendo]

1.- Un procedimiento de fabricar una estructura oligosacárida de Neisseria que comprende las etapas de delecionar un marco de lectura abierta que codifica una glicosiltransferasa de una cepa de Neisseria seleccionada de la lista que consiste en: LgtA, siendo su secuencia de aminoácidos de la cepa F62 de Neisseria gonorrhoeae la SEC ID Nº 3, LgtB, siendo su secuencia de aminoácidos de la cepa F62 de Neisseria gonorrhoeae la SEC ID Nº 8, LgtC, , siendo su secuencia de aminoácidos de la cepa F62 de Neisseria gonorrhoeae de la SEC ID Nº 4, LgtD, siendo su secuencia de aminoácidos de la cepa F62 de Neisseria gonorrhoeae de la SEC ID Nº 5 e LgtE, siendo su secuencia de aminoácidos de la cepa F62 de Neisseria gonorrhoeae 6, y preparar la estructura oligosacárida alterada de Neisseria a partir de dicha cepa. 2.- Un procedimiento de fabricar una preparación de vacuna eficaz contra las nuevas cepas de Neisseria que comprende las etapas de delecionar un marco de lectura abierto que codifica una glicosiltransferasa de una cepa de Neisseria seleccionada de la lista que consiste en: LgtA, siendo su secuencia de aminoácidos de la cepa F62 de Neisseria gonorrhoeae SEC ID Nº 3, LgtB, siendo su secuencia de aminoácidos de la cepa F62 de Neisseria gonorrhoeae es de la SEC ID Nº 8, LgtC, , siendo su secuencia de aminoácidos de la cepa F62 de Neisseria gonorrhoeae de la SEC ID Nº 4, LgtD, siendo su secuencia de aminoácidos de la cepa F62 de Neisseria gonorrhoeae de la SEC ID Nº 5 e LgtE, siendo su secuencia de aminoácidos de la cepa F62 de Neisseria gonorrhoeae 6, preparar una estructura oligosacárida alterada de Neisseria a partir de dicha cepa y formular dicha estructura oligosacárida de neisseria alterada de neisseria en una preparación de vacuna. 22   23   24     26   27   28   29     31   32   33   34     36   37   38   39     41   42   43   44