Biocatalizador inmovilizado basado en alginato para la biotransformación de carbohidratos.

Procedimiento de obtención de un biocatalizador, que comprende: inmovilizar una enzima fúngica por inclusión en un gel de alginato cálcico; y el secado posterior el biocatalizador inmovilizado obtenido en el paso (a). La invención también se refiere al biocatalizador obtenido por el procedimiento de la invención y que comprende enzimas fúngicas, preferiblemente fructosiltransferasa o {be}-fructofuranosidasa, inmovilizadas en alginato. Además la invención se refiere al uso de dicho biocatalizador para la biotransformación en las que el sustrato es una disolución concentrada de un carbohidrato y se puede llevar a cabo en un reactor continuo

Biocatalizador inmovilizado basado en alginato para la biotransformación de carbohidratos.

La presente invención se refiere a biocatalizadores que comprenden enzimas inmovilizadas en alginato y a su procedimiento de obtención. Además, mediante el secado de dicho biocatalizador, la invención también se refiere al uso de dicho biocatalizador para la biotransformación en las que el sustrato es una disolución concentrada de un carbohidrato y se puede llevar a cabo en un reactor continuo. Por tanto, la presente invención se puede encuadrar dentro del campo de la industria biotecnológica.

Estado de la técnica anterior

Los carbohidratos son el material biológico muy abundante en la naturaleza, se pueden utilizar como materia prima para una gran variedad de procesos industriales, dando lugar a otros productos con mucho interés industrial y tecnológico. Para ello, las enzimas implicadas en su transformación tienen un enorme interés.

El campo de los oligosacáridos prebióticos, como ingredientes funcionales en alimentación y nutracéuticos, se ha desarrollado de manera espectacular en los últimos años, estos compuestos se obtienen mediante transformaciones enzimáticas de carbohidratos.

El término prebiótico fue introducido por Gibson y Roberfroid, quienes definieron a los prebióticos como ingredientes no digeribles de los alimentos que afectan beneficiosamente al huésped por una estimulación selectiva del crecimiento y/o actividad de un limitado grupo de bacterias en el colon. Los prebióticos resisten la digestión en la parte superior del tracto intestinal, y se metabolizan por las bacterias endógenas del colon.

Las moléculas prebióticas líderes en el mercado son los fructooligosacáridos (FOS) (cfr. P.T. Sangeetha, M.N. Armes, S.G. Prapulla, Trends Food Sci. Technol., 2005, vol. 16, pp. 442-457; A.V. Rao, J. Nutr., 1998, vol. 80, pp.1442S-1445S). Los FOS pueden ejercer una serie de efectos sobre la persona que los consume: control del estreñimiento por aumento de la masa fecal, reducción de los episodios de diarreas causadas por rotavirus, mejora de los síntomas de intolerancia a la lactosa, aumento de la absorción de calcio, disminución de la capacidad mutagénica de ciertas enzimas microbianas como la nitro-reductasa (asociadas con el cáncer de colon), posible reducción de enfermedades relacionadas con dislipemias, etc.

Los FOS que se comercializan actualmente están formados por moléculas de fructosa unidas por enlaces glicosídicos β-(2-1), con una molécula de glucosa terminal (cfr. J.W. Yun, Enzyme Microb. Technol., 1996, vol. 19, pp. 107-117), abreviándose como GF_n, estando n típicamente comprendido entre 2 y 4 (1-kestosa, nistosa y ¹F-fructosilnistosa). Estudios recientes muestran que el mayor efecto prebiótico es ejercido por el trisacárido 1-kestosa, en comparación con compuestos de mayor peso molecular de la serie (cfr. O. Bañuelos et al., Anaerobe, 2008, vol. 14, pp. 184- 189).

Los FOS se obtienen por síntesis enzimática a partir de sacarosa, utilizando sacarosa 1-fructosiltransferasas (EC 2.4.1.9), beta-fructofuranosidasas -invertasas- (EC 3.2.1.26) o incluso levansacarasas (EC 2.4.1.10) (cfr. L.E. Trujillo et al., Enzyme Microb. Technol. 2001, vol. 28, pp. 139-144). Empleando beta-fructofuranosidasas el rendimiento de productos de síntesis que se alcanza es muy bajo, representando éstos menos del 4% (p/p) del total de carbohidratos de la mezcla. Sin embargo, con fructosiltransferasas el rendimiento que se puede alcanzar es mucho mayor, alcanzando valores próximos al 55-60% (p/p) de FOS referido al peso total de azúcares (cfr. M. Antosova, M. Polakovic, Chem. Pap. 2001, vol. 55, pp. 350-358). En la actualidad, los FOS se producen industrialmente utilizando fructosiltransferasas del género Aspergillus (p. ej. A. oryzae, A. japonicus, A. niger, A. aculeatus, etc.) o Aureobasidium (p. ej. A. pullulans) para generar oligosacáridos de cadena corta, de 3 a 5 unidades (cfr. C. Vannieeuwenburgh et al., Bioprocess Biosyst. Eng., 2002, vol. 25, pp. 13-20; C.S. Chien et al., Enzyme Microb. Technol., 2001, vol. 29, pp. 252- 257).

La producción a gran escala de oligosacáridos prebióticos sintetizados por vía enzimática puede verse favorecida si se inmoviliza la enzima en un soporte sólido. Este proceso facilita la separación del biocatalizador del medio con la consiguiente parada de la reacción, su reutilización y, en algunos casos, un aumento de su estabilidad operacional. Además, permite diseñar reactores continuos de diferente configuración (lecho fijo, lecho fluidizado, tanque agitado, etc.). Se han estudiado distintos métodos de inmovilización para enzimas que actúan sobre carbohidratos: adsorción, unión covalente, entrecruzamiento, granulación, atrapamiento, encapsulación, etc. En cuanto a los métodos de inmovilización por adsorción y granulación, éstos suelen ser inadecuados debido a que las reacciones tienen lugar en un medio acuoso y la enzima se desprende progresivamente del soporte (lixiviación).

Uno de los métodos de inmovilización más estudiados para enzimas glicosídicas es el atrapamiento en geles de alginato cálcico, debido a la facilidad para llevarlo a cabo, la ausencia de cambios conformacionales en la estructura de la enzima, el bajo precio de los materiales empleados y la elevada actividad recuperada. No obstante, esta metodología presenta todavía ciertos inconvenientes (cfr. U. Jahnz et al., Engineering and Manufacturing for Biotechnology, 2001, vol. 4, pp. 293-307). Por un lado, la estabilidad mecánica del gel es limitada en reactores que presenten una alta tensión tangencial. Además, si se utilizan tampones fosfato o citrato, tiene lugar la pérdida de calcio, lo que origina un deterioro del biocatalizador. Por otro lado, el alginato puede ser biodegradado en el propio reactor o durante el almacenamiento cuando se trabaja en condiciones no estériles. Un hecho muy notorio es que la actividad específica (más concretamente, la actividad por unidad de volumen) de los catalizadores basados en alginato no es muy alta, inferior a 10 U/ml gel (cfr. K.D. Reh et al., Enzyme Microb. Tech., 1996, vol. 19, pp. 518-524). Pero sin lugar a dudas el mayor inconveniente de los biocatalizadores basados en alginato consiste en la lixiviación de la enzima durante el transcurso de la biotransformación, ya que los poros de la red de alginato son excesivamente grandes para la mayor parte de las enzimas, siendo, por tanto, un método muy adecuado para la inmovilización de células enteras (viables o no). En algunos casos se ha descrito la eliminación del agua contenida en las esferas de alginato cálcico mediante un proceso de liofilización, sin embargo, en estos biocatalizadores tampoco se ha observado una reducción en el lixiviado de la enzima (cfr. S.S. Betigeri et al., Biomaterials, 2002, vol. 23, pp. 3627- 3636).

Dada la importancia industrial de los oligosacáridos prebióticos, es deseable proporcionar enzimas y procedimientos para su obtención, que sean viables industrialmente.

Descripción de la invención

La presente invención proporciona biocatalizadores inmovilizados y un procedimiento para la obtención de dichos biocatalizadores, donde una de sus aplicaciones es la producción de oligosacáridos prebióticos, principalmente 1-kestosa (GF2), nistosa (GF3), 1F-fructosilnistosa (GF4) y 1F-fructosil-fructosilnistosa (GF5). Estos oligosacáridos prebióticos pueden ser utilizados como ingredientes funcionales en productos alimenticios, alimentos infantiles y/o alimentación animal.

También, pueden tener otras aplicaciones, como puede ser la obtención de jarabes de fructosa como edulcorantes a partir de sacarosa.

Por tanto, un primer aspecto de la presente invención se refiere a un procedimiento de obtención de un biocatalizador (a partir de ahora procedimiento de la invención), que comprende:

a. inmovilizar una enzima fúngica por inclusión en un gel de alginato cálcico.

b. secar el biocatalizador inmovilizado obtenido en el paso (a).

En una realización preferida del procedimiento de invención, el secado se lleva a cabo a una temperatura de entre 30 y 50ºC, esta temperatura dependerá de la termoestabilidad de la enzima inmovilizada.

El término "enzima fúngica" se refiere en la presente invención a un enzima obtenida a partir de un microorganismo, más concretamente mediante... [Seguir leyendo]

1. Procedimiento de obtención de un biocatalizador, que comprende: