NUEVAS COMPOSICIONES VACUNALES ANTIPALÚDICAS Y SUS APLICACIONES.

Polipéptido del que: la secuencia N-terminal comprende la secuencia polipeptídica de la GBSSI (Granule Bound Starch Synthase I),

una secuencia polipeptídica que presenta un porcentaje de identidad de por lo menos 80% con dicha secuencia polipeptídica de la GBSSI o un fragmento de por lo menos 50 aminoácidos de dicha secuencia polipeptídica de la GBSSI; (i) presentando la secuencia polipeptídica la capacidad de fijarse al almidón; y (ii) comprendiendo la secuencia C-terminal una secuencia polipeptídica que codifica para por lo menos un epítopo de un antígeno de un parásito del género Plasmodium seleccionado preferentemente de entre el grupo constituido por Plasmodium falciparum, Plasmodium vivax, Plasmodium ovale y Plasmodium malariae

La presente invención se refiere al paludismo y, más específicamente, a un polipéptido destinado a la vacunación antipalúdica, a una composición farmacéutica que lo contiene y a la utilización de dicho polipéptido para la preparación de una composición destinada al tratamiento profiláctico del paludismo.

El paludismo, que resulta de una infección mediante un parásito del género Plasmodium, sigue siendo en la actualidad la endemia principal en el mundo con cerca de 300 y 500 millones de casos y más de 2,5 millones de muertes por año, de los cuales mayoritariamente niños de menos de cinco años (World Health Organization Tropical Disease Research, TDR Twelfth Program Report, p. 57-76, 1997). En la actualidad, más del 40% de la población mundial vive en las regiones en las que castiga el paludismo.

Se han desarrollado diferentes tratamientos profilácticos y terapéuticos contra este parásito, actuando las moléculas más eficaces durante la fase de infección de los glóbulos rojos. Se puede citar así la cloroquina (NIVAQUINE), la halofantrina (HALFAN), la mefloquina (LARIAM) y la quinina; siendo la quinina en la actualidad el medicamento de referencia. Sin embargo, numerosas de estas moléculas presentan importantes efectos secundarios y se observa la aparición de resistencias a ciertos medicamentos antipalúdicos desarrolladas por el parásito más peligroso (Plasmodium falciparum) en ciertas zonas geográficas.

Las vías de investigación de una vacuna antipalúdica son numerosas en la actualidad y se han podido identificar cerca de 40 antígenos que se pueden utilizar para la elaboración de una vacuna, dependiendo dichos antígenos del estado de desarrollo del parásito. Se pueden distinguir así para el estado intramosquito (estados sexuados); el antígeno Pfg27, Pfs16, Pfs25, Pfs28, Pfs45/48 o Pfs230; para el estado intravascular (esporozoito): el antígeno CSP-1, STARP, SALSA o SSP-2; para el estado intrahepático: el antígeno LSA-1, EXP-1, LSA-3, STARP, SALSA o SSP-2; y para el estado intra-eritrocito (merozoito): el antígeno RAP-1, RAP-2, SERA-1, MSP-1, MSP-2, MSP-3, MSP-4, MSP-5, AMA-1, EMP-1, Pf35, Pf55 o EBA-175.

A título de ejemplo de antígeno, se puede citar el antígeno membranario apical 1 (AMA1; numero de registro CAD42016 a CAD41967, CAD35671 a CAD35504, CAD34791 a CAD34741 y CAD31724 a CAD31720) que corresponde a una proteína transmembranaria identificada en el origen en Plasmodium knowlesi (DEANS et al., Clin. Exp. Immunol., vol. 49, p. 297-309, 1982; DEANS et al., Mol. Biochem. Parasitol., vol. 11, p. 189-204; 1984) y, ulteriormente, en otras especies que pertenecen al género Plasmodium (WATERS et al., J. Biol. Chem., vol. 265, p. 17974-17979, 1990). Esta proteína está presente en las organelas apicales del merozoito del parásito de la malaria en el estado esquizonte tardío (HEALER et al., Infect. Immun., vol. 70, p. 5751-5758, 2002; BANNISTER et al., J. Cell. Sci., vol. 116, p. 3825-3834, 2003) o en la superficie del merozoito en el estado de ruptura del esquizonte y de la invasión de los eritrocitos (NARUM y THOMAS, Mol. Biochem. Parasitol., vol. 67, p. 59-68, 1994). Se ha podido demostrar que la presencia de anticuerpos dirigidos contra el antígeno AMA1 permite impedir la invasión de eritrocitos (THOMAS et al., Mol. Biochem. Parasitol., vol. 13, p. 187-199, 1984; KOCKEN et al., J. Biol. Chem., vol. 273, p. 15119-15124, 1998; HODDER et al., Infect. Immun., vol. 69(5), p. 3286-94, 2001), que sugiere un papel crítico asociado a este antígeno de superficie. Además, se ha demostrado que la expresión de la proteína AMA1 es vital para la supervivencia del parásito (TRIGLIA et al., Mol. Microbiol., vol. 38, p. 706-718, 2000). Por último, se ha descrito la producción de AMA1 en diferentes sistemas, pero resulta problemática debido a las cantidades insuficientes (baculovirus) o problemas de repliegue (E. coli) relacionado con el gran número de puentes disulfúricos.

Se puede citar asimismo el antígeno MSP1 (Merozoite Surface Protein 1; número de registro BAA2624 a BAA2604, AAQ20930 a AAQ20923, y AAC69750 a AAC69718) que se sintetiza en el estado esquizonte y que está implicado en particular en la invasión eritrocitaria por el parásito. Durante esta última, la MSP1 sufre varios cortes proteolíticos durante el proceso de maduración del merozoito. Entre estos productos de escisión, un fragmento que corresponde al extremo C-terminal de MSP1 y que presenta una masa molecular de aproximadamente 42 kDa (MSP1-42; HOLDER et al., Parasitology, vol. 94, p.199-208, 1987; LYON et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, vol. 83, p. 29892993, 1986). El MSP1-42 sigue enganchado a la membrana del merozoito en la fase anterior a la invasión. En el mismo momento de la invasión, el MSP1-42 se escinde a su vez en dos fragmentos: un fragmento N-terminal de aproximadamente 33 kDa y un fragmento C-terminal de aproximadamente 19 kDa (MSP1-19; BLACKMAN et al., Mol, Biochem. Parasitol., vol. 50, p. 307-316, 1992). Este último corte es esencial para el éxito de la invasión, aunque el mecanismo del proceso no se haya elucidado aún. Debido a las dificultades para producir la proteína MSP1 debido a su tamaño importante (aproximadamente 200 kDa), los investigadores han estudiado esencialmente la porción C-terminal que presenta seguramente la función (desconocida hasta ahora) más importante. Por último, la producción de proteínas recombinantes que comprenden la parte C-terminal de MSP1 ha sido descrita en particular con una p19 y una p40 fusionadas cada una a una glutatión-S-transferasa producida en E. coli (BURGHAUS et al., Infection and Immunity, vol. 64, p. 3614-3619, 1996; KUMAR et al., Molecular Medicine, vol. 1 (3), p. 325-332, 1995),

o una p19 fusionada con un polipéptido derivado de una anatoxina tetánica y que contiene unos epítopos de células T auxiliares producido en S. cerevisiae (KUMAR et al., 1995, citado anteriormente). Sin embargo, estas diferentes proteínas recombinantes han mostrado una eficacia variable en términos de producción de anticuerpos después de la inyección en el mono.

Por último, y a pesar de los esfuerzos importantes emprendidos por la comunidad científica internacional, los diferentes candidatos vacunales ensayados han mostrado sólo una eficacia relativa y muy limitada para la protección contra el paludismo. Además, el hecho de que el paludismo se localice esencialmente a nivel de países en vías de desarrollo impone, para una eventual vacuna, responder a 3 criterios esenciales de (1) eficacia inmediata, (2) administración fácil y (3) bajo coste.

Es en este contexto donde los inventores han desarrollado una estrategia original que consiste en la utilización del almidón como vector que contiene unos epítopos de plasmodium falciparum con el fin de elaborar una vacuna.

El almidón, polímero de reserva por excelencia del reino vegetal, representa una de las fuentes más importantes de polisacáridos presentes en la tierra y se puede encontrar, en particular, en las plantas (maíz, patata, trigo, arroz, cebada, etc.), las algas, las microalgas, etc. El almidón se presenta en forma de granos insolubles, cuyo tamaño puede estar comprendido entre 0,1 y varias decenas de µm de diámetro, y se compone por dos sub-fracciones polisacarídicas denominadas amilosa y amilopectina, que representan cada una aproximadamente 25 y 75% en peso del grano de almidón respectivamente. Compuestas únicamente por residuos de glucosa unidos por enlaces alfa-1,4 y ramificados en alfa-1,6, estas dos fracciones difieren tanto desde un punto de vista arquitectural como en la naturaleza de las funciones enzimáticas que intervienen en su síntesis. Mientras que la amilopectina (la fracción principal del grano de almidón que le confiere su carácter cristalino) necesita un conjunto complejo de enzimas para su elaboración, la formación de la amilosa sólo necesita que intervenga una almidón-sintetasa particular denominada GBSS (Granule Bound Starch Synthase).

Varias isoformas de GBSS han sido aisladas en el maíz, el guisante, la patata o también el trigo (MACDONALD y PREISS, Plant Physiology, vol. 78, p. 849-852, 1985; SMITH, Planta, vol. 182, p. 599-604, 1990; DRY et al., The Plant Journal, vol. 2(2), p. 193-202, 1992; DENYER et al., Planta, vol. 196, p. 256-265, 1995). En todos los casos, es la GBSSI la que representa la isoforma principal; estando dicha isoforma implicada en la formación de amilosa durante la biogénesis del grano de almidón (TSAI, Biochemical Genetics, vol. 11 (2), p. 83-95, 1974; HOVENKAMPHERMELINK et al., Theorical and Applied Genetics, vol. 75, p. 217-221, 1987; DELRUE et al., Journal of Bacteriology, vol. 174(11), p. 3612-3620,... [Seguir leyendo]

1. Polipéptido del que:

la secuencia N-terminal comprende la secuencia polipeptídica de la GBSSI (Granule Bound Starch Synthase I), una secuencia polipeptídica que presenta un porcentaje de identidad de por lo menos 80% con dicha secuencia polipeptídica de la GBSSI o un fragmento de por lo menos 50 aminoácidos de dicha secuencia polipeptídica de la GBSSI;

(i) presentando la secuencia polipeptídica la capacidad de fijarse al almidón; y

(ii) comprendiendo la secuencia C-terminal una secuencia polipeptídica que codifica para por lo menos un epítopo de un antígeno de un parásito del género Plasmodium seleccionado preferentemente de entre el grupo constituido por Plasmodium falciparum, Plasmodium vivax, Plasmodium ovale y Plasmodium malariae.

2. Polipéptido según la reivindicación 1, caracterizado porque la secuencia polipeptídica de la GBSSI se selecciona de entre el grupo constituido por la GBSSI de Chlamydomonas reinharditii (SEC ID nº: 1), de trigo (Triticum aestivum; SEC ID nº: 2), de maíz (Zea mays; SEC ID nº: 3), de guisante (Pisum sativum; SEC ID nº: 4), de arroz (Oriza sativa; SEC ID nº: 5), de cebada (Hordeum vulgare; SEC ID nº: 6), de patata (Solanum tuberosum; SEC ID nº: 7), de soja (Glycine max; SEC ID nº: 8) y de judía verde (Phaseolus vulgaris; SEC ID nº: 9), preferentemente, la secuencia polipeptídica de la GBSSI corresponde a la secuencia polipeptídica de la GBSSI de Chlamydomonas reinhardtii (SEC ID nº: 1).

3. Polipéptido según cualquiera de las reivindicaciones anteriores, caracterizado porque los fragmentos de GBSSI capaces de unirse al almidón se seleccionan de entre el grupo constituido por la secuencia polipeptídica comprendida entre las posiciones 1 y 438 de la GBSSI de Chlamydomonas reinhardtii (SEC ID nº: 1), 1 y 449 de la GBSSI de trigo (Triticum aestivum; SEC ID nº: 2), 1 y 437 de la GBSSI de maíz (Zea mays; SEC ID nº: 3), 1 y 432 de la GBSSI de guisante (Pisum sativum; SEC ID nº: 4), 1 y 436 de la GBSSI de arroz (Oriza sativa; SEC ID nº: 5), 1 y 437 de la GBSSI de cebada (Hordeum vulgare; SEC ID nº: 6), 1 y 434 de la GBSSI de patata (Solanum tuberosum; SEC ID nº: 7), 1 y 435 de la GBSSI de soja (Glycine max; SEC ID nº: 8) y 1 y 431 de la GBSSI de judía verde (Phaseolus vulgaris; SEC ID nº: 9).

4. Polipéptido según cualquiera de las reivindicaciones anteriores, caracterizado porque dicho antígeno se selecciona de entre el grupo constituido por los antígenos Pfg27/25 (SEC ID nº: 10), Pfs16 (SEC ID nº: 11), Pfs25 (SEC ID nº: 12), Pfs28 (SEC ID nº: 13), Pfs48/45 (SEC ID nº: 14), Pfs230 (SEC ID nº: 15), CSP-1 (SEC ID nº: 16), STARP (SEC ID nº: 17), SALSA (SEC ID nº: 18), SSP-2 (SEC ID nº: 19), LSA-1 (SEC ID nº: 20), EXP-1 (SEC ID nº: 21), LSA-3 (SEC ID nº: 22), RAP-1 (SEC ID nº: 23), RAP-2 (SEC ID nº: 24), SERA-1 (SEC ID nº: 25), MSP-1 (SEC ID nº: 26), MSP-2 (SEC ID nº: 27), MSP-3 (SEC ID nº: 28), MSP-4 (SEC ID nº: 29), MSP-5 (SEC ID nº: 30), AMA-1 (SEC ID nº: 31), EMP-1 (SEC ID nº: 32) et EBA-175 (SEC ID nº: 33), preferentemente, dicho antígeno corresponde al antígeno MSP1 (SEC ID nº: 26) o al antígeno AMA-1 (SEC ID nº: 31).

5. Polipéptido según la reivindicación 4, caracterizado porque dicho epítopo presenta una secuencia polipeptídica de por lo menos 6 aminoácidos, preferentemente de por lo menos 8 aminoácidos, derivada de la secuencia polipeptídica de dicho antígeno y preferentemente dicho epítopo consiste en una secuencia polipeptídica que presenta un porcentaje de identidad de por lo menos 70%, preferentemente de por lo menos 80% con la secuencia polipeptídica de dicho antígeno.

6. Polipéptido según la reivindicación 5, caracterizado porque la secuencia polipeptídica del epítopo comprende unas sustituciones con respecto a la secuencia polipeptídica de dicho antígeno, con el fin de mejorar el anclaje y así la presentación del polipéptido que corresponde a dicho epítopo por las moléculas de CMH de clase II.

7. Polipéptido según la reivindicación 5, caracterizado porque dicho antígeno corresponde al antígeno MSP1 (SEC ID nº: 26) y porque la secuencia polipeptídica que codifica para por lo menos un epítopo de dicho epítopo es la secuencia SEC ID nº: 34, preferentemente dicho polipéptido presenta la secuencia SEC ID nº: 35.

8. Polipéptido según la reivindicación 5, caracterizado porque dicho antígeno corresponde al antígeno AMA-1 (SEC ID nº: 31) y porque la secuencia polipeptídica que codifica para por lo menos un epítopo de dicho antígeno es la secuencia SEC ID nº: 36, preferentemente dicho polipéptido presenta la secuencia SEC ID nº 37.

9. Polipéptido según cualquiera de las reivindicaciones anteriores, caracterizado porque comprende una secuencia polipeptídica de unión entre las secuencias N-y C-terminales, preferentemente dicha secuencia de unión comprende un sitio de escisión peptídica que permite liberar el epítopo después de la purificación de dicho polipéptido según la invención.

10. Polinucleótido que codifica para un polipéptido según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 9.

11. Vector que comprende un polinucleótido según la reivindicación 10.

12. Célula transformada por un vector según la reivindicación 11.

5 13. Organismo, con la excepción del ser humano, transformado, caracterizado porque comprende una célula según la reivindicación 12.

14. Composición farmacéutica que comprende por lo menos un polipéptido según cualquiera de las reivindicaciones

1 a 9, eventualmente asociado a un soporte farmacéuticamente aceptable, estando dicho polipéptido 10 preferentemente asociado a unos granos de almidón.

15. Utilización de un polipéptido según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 9 para la fabricación de un medicamento destinado al tratamiento profiláctico de un sujeto de una patología asociada a un parásito del género Plasmodium, preferentemente del paludismo.