PROCESO DE CLIVAJE ENZIMÁTICO DE POLISACÁRIDOS PROCEDENTES DE ALGAS.

Proceso de clivaje enzimático de polisacáridos que comprenden una primera secuencia [→

4)-ß-D-GlcpA-(1→4)-α-L-Rhap3-sulfato-(1→]n y una segunda secuencia [→4)-α-L-IdopA-(1→4)-α-L-Rhap3-sulfato-(1→]m, estando compuestas las secuencias primera y segunda de dos unidades osas unidas por un enlace osídico respectivamente, siendo dicho proceso del tipo según el cual:

- se proporcionan dichas secuencias de polisacárido;

- se proporciona un microorganismo apto para producir una sustancia enzimática del tipo liasa; y,

- se pone en contacto esta sustancia enzimática con dichas secuencias de polisacárido de modo que se provoca el clivaje del enlace osídico según una reacción de ß-eliminación siguiendo el mecanismo esquemático:

caracterizado porque se selecciona un microorganismo que pertenece a las bacterias del género Ochrobactrum para producir la mencionada sustancia enzimática.

Proceso de clivaje enzimático de polisacáridos procedentes de algas La presente invención se refiere a un proceso de clivaje enzimático de polisacáridos extraídos de algas del género Ulva.

Los polisacáridos son polímeros y constituyen los elementos esenciales de las algas verdes del género Ulva. Además, estas algas verdes están muy extendidas en las costas de todos los continentes y, por ello, están ampliamente disponibles a bajo coste.

Estos polímeros se denominan “ulvanos” y contienen osas ácidas, en particular ácido glucurónico (GlcpA) y ácido idurónico (IdopA) , así como osas neutras, entre las cuales se encuentran ramnosa (Rhap) , galactosa (Galp) , glucosa (Glcp) y xilosa (Xylp) . Además, en estos polímeros, la ramnosa está sustituida con un grupo sulfato en el carbono 3, denominándose ramnosa-3-sulfato (Rhap3S) .

Estos polímeros contienen compuestos interesantes, en particular ácido idurónico y ramnosa-3-sulfato, en especial para aplicaciones terapéuticas o cosméticas.

Sin embargo, las osas de estos polímeros se encadenan de forma relativamente aleatoria, de modo que resulta difícil extraer una composición relativamente homogénea. Se han identificado dos secuencias principales, denominadas ácidos aldobiurónicos, que incluyen tales compuestos interesantes, una primera secuencia [º4) -º-D-GlcpA- (1º4) -a-LRhap3-sulfato- (1º]n y una segunda secuencia [º4) -a-L-IdopA- (1º4) -a-L-Rhap3-sulfato- (1º]m. También se han descrito secuencias que contienen los enlaces de ácido glucurónico, que son: [º4) -º-D-GlcpA- (1º4) -º-D-GlcpA- (1º]x; pudiendo estar estas secuencias de glucuronano integradas en las 2 secuencias principales constituidas de los ácidos aldobiurónicos ya citados. Sin embargo, aunque no se ha demostrado, estas secuencias de glucuronano podrían estar presentes también en otros polímeros diferentes de los ulvanos, pero también extraídos del alga al mismo tiempo que el polímero compuesto en su mayoría por secuencias de ácidos aldobiurónicos.

Estos compuestos son comparables respectivamente a los glucosaminoglicanos, en especial a la heparina y al sulfato de heparano, así como al sulfato de condroitina y sulfato de dermatano.

Sin embargo, por muy interesantes que sean, estos polímeros extraídos de las algas verdes presentan una heterogeneidad demasiado alta como para poder ser utilizados e incorporados tal cual en preparaciones farmacéuticas o cosméticas. Por ello, que se intentado fraccionarlos en compuestos elementales mediante composiciones enzimáticas específicas.

Así, ya se ha identificado una primera enzima del tipo liasa, la glucuronano-liasa, que presenta activad en el clivaje de las secuencias de glucuronano presentes en los polisacáridos tipo ulvanos. Además, esta enzima se obtiene a partir de un microorganismo fúngico, en particular de la cepa Trichoderma CNCM I-3400. Se remite al documento FR 2 885 911, que describe este microorganismo para degradar las secuencias glucuronano de los polisacáridos.

Sin embargo, esta composición enzimática no permite clivar de forma precisa las secuencias principales compuestas de los ácidos aldobiurónicos ya mencionados, cuyo fruto es de gran interés.

Por otra parte, se conoce otra composición enzimática del tipo liasa, la ulvano- liasa, que permite, a priori, el clivaje de las secuencias primera y segunda de los ácidos aldobiurónicos citados en lo que se refiere a los enlaces osídicos, entre las unidades Rhap3-sulfato y GlcpA de una parte, y entre las unidades Rhap3 e IdopA de otra, y siguiendo una reacción de º-eliminación.

Esta composición enzimática se describe en la publicación de M. Lahaye y col., (Carbohydrate Research 1997, 304:325333) y procede de una bacteria marina. Permite fraccionar los polímeros de ulvano en sus oligómeros.

Sin embargo, la composición enzimática descrita en esta publicación y especialmente su actividad enzimática con respecto al sustrato compuesto de polímeros ulvano es relativamente débil, y además, disminuye rápidamente con la degradación, de modo que es necesario reintroducir enzimas en la composición enzimática para que la degradación prosiga. Efectivamente, la publicación citada indica que la degradación del ulvano por el extracto enzimático aislado es lenta y alcanza rápidamente una meseta. Así, se describe que el incremento de los azúcares reductores sobre el ulvano sometido a la degradación enzimática, incremento que es idéntico lógicamente al de los azúcares en posición terminal no reductora, es del 7, 1% con respecto a la dosificación de estos azúcares antes de la incubación en presencia de la enzima; además, esta degradación, completada en 200 minutos, necesita repetidas adiciones de enzima, cada 25 minutos como promedio, para compensar la inactivación enzimática debida a productos de degradación. Por consiguiente, no es factible utilizar esta composición enzimática para producir industrialmente oligómeros de composición y peso molecular homogéneos, ya que el coste para obtener estos oligómeros sería prohibitivo.

Asimismo, un problema que se plantea y que la presente invención pretende resolver consiste en proporcionar, según un primer aspecto, un proceso de clivaje enzimático que permita no sólo clivar los polímeros ulvano entre las unidades Rhap3-sulfato y GlcpA y entre las unidades Rhap3 e IdopA, sino también hacerlo con un rendimiento que permita obtener oligómeros de tamaño reducido a un coste ventajoso.

Con el fin de resolver este problema, la presente invención propone un proceso de clivaje enzimático de polisacáridos que comprenden una primera secuencia [ 4) -º-D-GlcpA- (1º4) -a-L-Rhap3-sulfato- (1 º]n y una segunda secuencia [º4) -a-L-IdopA- (1º4) -a-L-Rhap3-sulfato- (1 º]m, estando compuestas respectivamente ambas secuencias de dos unidades osa unidas por un enlace osídico, dicho proceso siendo del tipo según el cual: se proporcionan dichas secuencias de polisacárido; se proporciona un microorganismo apto para producir una sustancia enzimática del tipo liasa; y se pone en contacto dicha sustancia enzimática con las secuencias de polisacáridos de modo que se provoque el clivaje del enlace osídico según una reacción de º-eliminación, siguiendo el mecanismo esquemático:

Según la invención, se selecciona un microorganismo que pertenece a las bacterias del género Ochrobactrum para producir dicha sustancia enzimática.

Así, una característica de la invención consiste en proporcionar estas bacterias del género Ochrobactrum para producir una sustancia enzimática apta para romper específicamente el enlace osídico mediante º-eliminación, pero sin provocar la aparición de productos de degradación que alterarían da precisión de la actividad enzimática. Y ello, contrariamente al caso de las sustancias enzimáticas descritas en la técnica anterior y procedentes de bacterias marinas, cuya actividad enzimática se interrumpe muy rápidamente y para las cuales entonces es necesario introducir en el medio de reacción nuevas sustancias enzimáticas con el fin de continuar la degradación.

Por lo demás, la º-eliminación corresponde a un clivaje del enlace osídico de una secuencia osídica generando 2 fragmentos de moléculas sacáridas y que hace aparecer, al nivle del extremo terminal no reductor creado, un heterociclo que presenta un enlace etilénico entre el carbono 4 y el carbono 5, correspondiendo el residuo del extremo terminal no reductor a un ácido 4-desoxi- (hex-4-eno) piranosilurónico. Por otra parte, tal como se explicará más adelante, gracias a la aparición de este enlace etilénico, se podrá medir fácilmente la velocidad de reacción mediante espectroscopía UV, entre 230 y 240 nm y especialmente a 235 nm.

Igualmente, se observará que el clivaje entre las unidades Rhap3-sulfato y GlcpA y entre las unidades Rhap3 e IdopA lleva exactamente a los mismos productos de reacción, aunque, por un lado, para la primera secuencia se tenga en el polímero ácido glucurónico, mientras que para la segunda secuencia se tenga el ácido idurónico. Ello se debe a que estos dos ácidos difieren simplemente en la configuración de su carbono 5. Así, debido a que el carbono 5 presenta una hibridación sp3 inicialmente y que después se convierte en sp2 tras la reacción de º-eliminación, sólo existe una configuración posible.

Por tanto, la sustancia enzimática obtenida gracias a la bacteria del género Ochrobactrum no sólo permite obtener oligómeros de... [Seguir leyendo]

1. Proceso de clivaje enzimático de polisacáridos que comprenden una primera secuencia .

4. º-D-GlcpA (1º4) -a-L-Rhap3-sulfato- (1º ]n y una segunda secuencia .

4. a-L-IdopA- (1�.

4. a-L-Rhap3-sulfato- (1º]m, estando compuestas las secuencias primera y segunda de dos unidades osas unidas por un enlace osídico respectivamente, siendo dicho proceso del tipo según el cual:

se proporcionan dichas secuencias de polisacárido;

se proporciona un microorganismo apto para producir una sustancia enzimática del tipo liasa; y, se pone en contacto esta sustancia enzimática con dichas secuencias de polisacárido de modo que se provoca el clivaje del enlace osídico según una reacción de º-eliminación siguiendo el mecanismo esquemático:

caracterizado porque se selecciona un microorganismo que pertenece a las bacterias del género Ochrobactrum para producir la mencionada sustancia enzimática.

2. Proceso de clivaje enzimático según la reivindicación 1, caracterizado porque la cepa bacteriana selecionada pertenece a la especie Ochrobactrum tritici.

15 3. Proceso de clivaje enzimático según la reivindicación 1 ó 2, caracterizado porque se incuban dichas bacterias con un sustrato polisacarídico con el fin de producir la sustancia enzimática y porque se aíslan las bacterias incubadas de dicha sustancia enzimática.

4. Proceso de clivaje enzimático según la reivindicación 3, caracterizado porque dicha sustancia enzimática se purifica para retener la enzima específica del clivaje del enlace osídico.

20 5. Proceso de clivaje enzimático según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4, caracterizado porque la sustancia enzimática provoca el clivaje de un número de enlaces osídicos de dichas secuencias de polisacárido comprendido entre 6·1016 y 6·1020 por minuto y miligramo de dicha sustancia enzimática.

6. Proceso de clivaje enzimático según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5, caracterizado porque se extraen dichas secuencias de polisacáridos a partir de un alga del género Ulva.

25 7. Proceso de clivaje enzimático según la reivindicación 6, caracterizado porque, comprendiendo además dichos polisacáridos secuencias que incluyen glucuronano, se elimina dicha secuencia que incluye glucuronano, de las citadas secuencias primera y segunda .

4. º-D-GlcpA- (1º4) -a-L-Rhap3-sulfato- (1º]n, [º4) -a-L-IdopA- (1º4) -a-L-Rhap3sulfato- (1º]m.

8. Proceso de clivaje enzimático según la reivindicación 6 ó 7, caracterizado porque dichos polisacáridos comprenden además heparanos que incluyen polímeros compuestos de .

4. º-D-GlcpA-2-sulfato- (1�.

4. a-DGlcNsulfo-6-sulfato- (1º]x y/o de [º4) -a-L-IdopA-2-sulfato- (1º4) -a-D-GlcNsulfo-6-sulfato- (1º]y.

9. Sustancia enzimática del tipo de las liasas adaptada al proceso de clivaje enzimático según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 8, caracterizada porque se obtiene a partir de un microorganismo que pertenece a las bacterias del género Ochrobactrum.

10. Sustancia enzimática según la reivindicación 9, caracterizada porque la cepa bacteriana pertenece a la especie Ochrobactrum tritici.

11. Sustancia enzimática según la reivindicación 10, caracterizada porque la cepa bacteriana es la cepa Ochrobactrum tritici CNCM I-3776.

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