PROCEDIMIENTO DE PRODUCCIÓN DE L-LISINA.

LA CAPACIDAD DE PRODUCCION DE L RIA CORINEFORME PORTADORA DE UNA ASPARTOQUINASA EN LA QUE LA RETROINHIBICION POR L ANCIALMENTE DESENSIBILIZADA ESTIMULANDO SUCESIVAMENTE EL DNA QUE CODIFICA UNA DIHIDROPICOLINATO REDUCTASA,

EL DNA QUE CODIFICA UNA DIHIDROPICOLINATO SINTASA, EL DNA QUE CODIFICA UNA DIAMINOPIMELATO DESCARBOXILASA Y EL DNA QUE CODIFICA UNA DIAMINOPIMELATO DESHIDROGENASA

Tipo: Patente Internacional (Tratado de Cooperación de Patentes). Resumen de patente/invención. Número de Solicitud: PCT/JP1996/001511.

Solicitante: AJINOMOTO CO., INC..

Nacionalidad solicitante: Japón.

Dirección: 15-1, KYOBASHI 1-CHOME, CHUO-KU TOKYO 104-8315 JAPON.

Inventor/es: SUGIMOTO, MASAKAZU, YOSHIHARA, YASUHIKO, NAKAMATSU, TSUYOSHI, HAYAKAWA, ATSUSHI, OTSUNA,Seiko, IZUI,Masako, NAKANO,Eiichi, KOBAYASHI,Masaki.

Fecha de Publicación: .

Fecha Solicitud PCT: 5 de Junio de 1996.

Clasificación Internacional de Patentes:

  • C12N15/52 SECCION C — QUIMICA; METALURGIA.C12 BIOQUIMICA; CERVEZA; BEBIDAS ALCOHOLICAS; VINO; VINAGRE; MICROBIOLOGIA; ENZIMOLOGIA; TECNICAS DE MUTACION O DE GENETICA.C12N MICROORGANISMOS O ENZIMAS; COMPOSICIONES QUE LOS CONTIENEN (biocidas, productos que repelen o atraen a los animales nocivos, o reguladores del crecimiento de los vegetales, que contienen microorganismos virus, hongos microscópicos, enzimas, productos de fermentación o sustancias obtenidas por o extraídas de microorganismos o sustancias animales A01N 63/00; preparaciones de uso médico A61K; fertilizantes C05F ); PROPAGACION,CULTIVO O CONSERVACION DE MICROORGANISMOS; TECNICAS DE MUTACION O DE INGENIERIA GENETICA; MEDIOS DE CULTIVO (medios para ensayos microbiológicos C12Q 1/00). › C12N 15/00 Técnicas de mutación o de ingeniería genética; ADN o ARN relacionado con la ingeniería genética, vectores, p. ej. plásmidos, o su aislamiento, su preparación o su purificación; Utilización de huéspedes para ello (mutantes o microorganismos modificados por ingeniería genética C12N 1/00, C12N 5/00, C12N 7/00; nuevas plantas en sí A01H; reproducción de plantas por técnicas de cultivo de tejidos A01H 4/00; nuevas razas animales en sí A01K 67/00; utilización de preparaciones medicinales que contienen material genético que es introducido en células del cuerpo humano para tratar enfermedades genéticas, terapia génica A61K 48/00; péptidos en general C07K). › Genes que codifican enzimas o proenzimas.
  • C12N15/77 C12N 15/00 […] › para Corynebacterium; para Brevibacterium.
  • C12N9/06B1B
  • C12N9/12B2
  • C12N9/88 C12N […] › C12N 9/00 Enzimas, p. ej. ligasas (6.; Proenzimas; Composiciones que las contienen (preparaciones para la limpieza de los dientes que contienen enzimas A61K 8/66, A61Q 11/00; preparaciones de uso médico que contienen enzimas A61K 38/43; composiciones detergentes que contienen enzimas C11D ); Procesos para preparar, activar, inhibir, separar o purificar enzimas. › Liasas (4.).
  • C12P13/08 C12 […] › C12P PROCESOS DE FERMENTACION O PROCESOS QUE UTILIZAN ENZIMAS PARA LA SINTESIS DE UN COMPUESTO QUIMICO DADO O DE UNA COMPOSICION DADA, O PARA LA SEPARACION DE ISOMEROS OPTICOS A PARTIR DE UNA MEZCLA RACEMICA.C12P 13/00 Preparación de compuestos orgánicos que contienen nitrógeno. › Lisina; Acido diaminopimélico; Treonina; Valina.

Clasificación PCT:

  • C12N1/21 C12N […] › C12N 1/00 Microorganismos, p.ej. protozoos; Composiciones que los contienen (preparaciones de uso médico que contienen material de protozoos, bacterias o virus A61K 35/66, de algas A61K 36/02, de hongos A61K 36/06; preparación de composiciones de uso médico que contienen antígenos o anticuerpos bacterianos, p. ej. vacunas bacterianas, A61K 39/00 ); Procesos de cultivo o conservación de microorganismos, o de composiciones que los contienen; Procesos de preparación o aislamiento de una composición que contiene un microorganismo; Sus medios de cultivo. › modificados por la introducción de material genético extraño.
  • C12N15/77 C12N 15/00 […] › para Corynebacterium; para Brevibacterium.
  • C12P13/08 C12P 13/00 […] › Lisina; Acido diaminopimélico; Treonina; Valina.

Clasificación antigua:

  • C12N1/21 C12N 1/00 […] › modificados por la introducción de material genético extraño.
  • C12N15/52 C12N 15/00 […] › Genes que codifican enzimas o proenzimas.
  • C12P13/08 C12P 13/00 […] › Lisina; Acido diaminopimélico; Treonina; Valina.

Países PCT: Alemania, Dinamarca, España, Francia, Reino Unido, Italia, Países Bajos.

PDF original: ES-2373863_T3.pdf

 

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Fragmento de la descripción:

Procedimiento de producción de L-lisina.

Campo técnico

La presente invención se refiere a un procedimiento de producción de L-lisina cultivando un microorganismo obtenido modificando una bacteria corineforme usada para producción fermentativa de aminoácidos o similares por medio de una técnica basada en ingeniería genética.

Técnica anterior

La L-lisina, que se usa como un aditivo del forraje, se produce usualmente por un procedimiento fermentativo usando una cepa mutante de producción de L-lisina que pertenece a las bacterias corineformes. Diversas bacterias que producen L-lisina conocidas en la actualidad son aquellas creadas por mutación artificial partiendo de cepas de tipo silvestre que pertenecen a las bacterias corineformes.

En cuanto a las bacterias corineformes, se ha desvelado un plásmido vector que es autónomamente replicable en células bacterianas y tiene un gen marcador de resistencia a fármacos (véase Patente de los Estados Unidos N.º 4, 514, 502) y un procedimiento para introducir un gen en células bacterianas (por ejemplo, Patente japonesa abierta a inspección pública N.º 2-207791) . Hay también revelada una posibilidad para reproducir una bacteria que produzca L-treonina- o L-isoleucina usando las técnicas según se describen anteriormente (véanse Patentes de Estados Unidos N.ºs 4.452.890 y 4.442.208) . En cuanto a la cría de una bacteria que produce L-lisina, se conoce una técnica, en la que un gen que participa en la biosíntesis de L-lisina se incorpora a un plásmido de vector para amplificar el gen en las células bacterianas (por ejemplo, Patente japonesa abierta a inspección pública N.º 56160997) .

Los genes conocidos para biosíntesis de L-lisina incluyen, por ejemplo, un gen de dihidrodipicolinato reductasa (Patente japonesa abierta a inspección pública N.º 7-75578) y un gen de diaminopimelato deshidrogenasa (Ishino, S. y cols., Nucleic Acids Res., 15, 3917 (1987) ) en los que está clonado un gen biosíntesis de L-lisina, así como un gen de fosfoenolpiruvato carboxilasa (Patente japonesa abierta a inspección pública N.º 60-87788) , un gen de dihidrodipicolinato sintasa (Patente japonesa abierta a inspección pública N.º 6-55149) y un gen de diaminopimelato descarboxilasa (Patente japonesa abierta a inspección pública N.º 60-62994) en los que la amplificación de un gen afecta a la productividad de L-lisina.

En cuanto a las enzimas que participan en la biosíntesis de L-lisina, se conoce un caso de una enzima que sufre inhibición de retrolimentación cuando se usa como un tipo silvestre. En este caso, la productividad de L-lisina se mejora introduciendo un gen de enzima que tenga tal mutación que la inhibición de retroalimentación esté desensibilizada. Aquellos conocidos como un gen tal incluyen específicamente, por ejemplo, un gen de aspartocinasa (Panfleto de Publicación Internacional de WO 94/25605) .

Como se describe anteriormente, ciertos resultados exitosos se han obtenido por medio de amplificación de genes por el sistema de biosíntesis de L-lisina, o por introducción de genes mutantes. Por ejemplo, una bacteria corineforme, que alberga un gen de aspartocinasa mutante con inhibición concertada desensibilizada por lisina y treonina, produce una cantidad considerable de L-lisina (aproximadamente 25 g/l) . Sin embargo, esta bacteria sufre disminución de la velocidad de crecimiento comparada con una bacteria que alberga gen de aspartocinasa no mutante. Se informó también que la productividad de L-lisina se mejora introduciendo adicionalmente un gen de dihidropicolinato sintasa además de un gen de aspartocinasa mutante (Applied and Environmental Microbiology, 57 (6) , 1746-1752 (1991) ) . Sin embargo, una bacteria tal sufre la disminución adicional en velocidad de crecimiento.

En cuanto al gen de dihidropicolinato reductasa, se ha demostrado que la actividad de dihidropicolinato reductasa está incrementada en una bacteria corineforme en la que se ha introducido el gen, sin embargo, no está incluido ningún informe para la influencia en productividad de L-lisina (Patente japonesa abierta a inspección pública N.º 775578) .

En las circunstancias presentes, no se conoce ningún caso para la bacteria corineforme, en la que cualquiera haya tenido éxito en mejora remarcable en rendimiento de L-lisina sin restringir crecimiento combinando una pluralidad de genes para biosíntesis de L-lisina. No se ha comunicado ningún caso en el que se desee mejorar el crecimiento potenciando un gen para biosíntesis de L-lisina también.

Revelación de la invención

Un objeto de la presente invención es mejorar la capacidad de producir L-lisina y la velocidad de crecimiento de una bacteria corineforme usando materiales genéticos de secuencias de ADN que codifican cada una para aspartocinasa (de ahora en adelante referida como "AK", con la condición de que un gen que codifica para una proteína AK se refiera de ahora en adelante como "lysC", si es necesario) , dihidrodipicolinato reductasa (de ahora en adelante referida como "DDPR", con la condición de que un gen que codifica para una proteína DDPR se refiera de ahora en adelante como "dapB", si es necesario) , dihidrodipicolinato sintasa (de ahora en adelante abreviada como "DDPS", con la condición de que un gen que codifica para una proteína DDPS se refiere de ahora en adelante como "dapA", si es necesario) , diaminopimelato descarboxilasa (de ahora en adelante referida como "DDC", con la condición de que un gen que codifica para una proteína DDC se refiere de ahora en adelante como "lysA", si es necesario) , y diaminopimelato deshidrogenasa (de ahora en adelante referida como "DDH", con la condición de que un gen que codifica para una proteína DDH se refiere de ahora en adelante como "ddh", si es necesario) que son enzimas importantes para biosíntesis de L-lisina en células de bacterias corineformes.

Cuando una sustancia objetivo se produce fermentativamente usando un microorganismo, la velocidad de producción, así como el rendimiento de la sustancia objetivo en relación a un material introducido, es un factor extremadamente importante. Una sustancia objetivo se puede producir de forma remarcablemente económica incrementando la velocidad de producción por una unidad de equipamiento de fermentación. De acuerdo con ello, es industrialmente extremadamente importante que el rendimiento fermentativo y la velocidad de producción sean compatibles el uno con la otra. La presente invención propone una solución para el problema como se describe anteriormente con el fin de producir fermentativamente L-lisina usando una bacteria corineforme.

El principio de la presente invención está basado en el hecho que el crecimiento de una bacteria corineforme puede mejorarse y la velocidad de producción de L-lisina de la misma se puede llevar a cabo realizando potenciación en tanto que combinamos dauB con lysC mutante (de ahora en adelante referido simplemente como "mutante lvsC", si es necesario) que codifica AK mutante (de ahora en adelante referida simplemente como "mutante AK", si es necesario) en la que la inhibición concertada por lisina y treonina está desensibilizada, según se compara con un caso en el que lysC está potenciada individualmente y en el que la velocidad de producción de L-lisina se puede mejorar adicionalmente en una manera por etapas potenciando sucesivamente dapA, lysA y ddh.

Concretamente, la presente invención radica en un vector autónomamente replicable en células de bacterias corineformes, que comprenden una secuencia de ADN que codifica para una aspartocinasa en la que la inhibición por retroalimentación por L-lisina y L-treonina está desensibilizada y una secuencia de ADN que codifica una dihidrodipicolinato reductasa obtenida de una bacteria corineforme. La presente invención proporciona un vector que comprende adicionalmente una secuencia de ADN que codifica para una dihidropicolinato sintasa, además de cada una de las secuencias de ADN descritas anteriormente. La presente invención proporciona un vector que comprende adicionalmente una secuencia de ADN que codifica para una diaminopimelato descarboxilasa, además de las tres secuencias de ADN descritas anteriormente. La presente invención proporciona un vector adicional que comprende una secuencia de ADN que codifica para una diaminopimelato deshidrogenasa, además de las cuatro secuencias de ADN descritas... [Seguir leyendo]

 


Reivindicaciones:

1. Un vector replicable autónomamente en células de bacterias corineformes, que comprende una secuencia de ADN que codifica para una aspartocinasa en la que la inhibición por retroalimentación por L-lisina y L-treonina está desensibilizada y una secuencia de ADN que codifica para una dihidrodipicolinato reductasa obtenida de una bacteria corineforme.

2. El vector de acuerdo con la reivindicación 1, que comprende adicionalmente una secuencia de ADN que codifica para una dihidropicolinato sintasa.

3. El vector de acuerdo con la reivindicación 2, que comprende adicionalmente una secuencia de ADN que codifica para una diaminopimelato descarboxilasa.

4. El vector de acuerdo con la reivindicación 3, que comprende adicionalmente una secuencia de ADN que codifica para una diaminopimelato deshidrogenasa.

5. El vector de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4, en el que dicha aspartocinasa en la que la inhibición por retroalimentación por L-lisina y L-treonina está desensibilizada es una aspartocinasa que se origina de bacterias corineformes y en el que dicha aspartocinasa está proporcionada como aspartocinasa mutante en la que un 279 enésimo residuo de alanina según se cuenta a partir de su extremo N-terminal en la secuencia de aminoácidos mostrada en la SEC ID N.º: 5 está cambiado por un residuo de aminoácido distinto de alanina y distinto de aminoácido ácido en su subunidada y un 30 enésimo residuo de alanina según se cuenta a partir de su extremo N-terminal en la secuencia de aminoácidos mostrada en la SEC ID N.º: 7 está cambiado por un residuo de

aminoácido distinto de alanina y distinto de aminoácido ácido en su subunidad 1.

6. El vector de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4, en el que dicha secuencia de ADN que codifica para la dihidrodipicolinato reductasa codifica para una secuencia de aminoácidos representada en la SEC ID N.º: 11 en el Listado de secuencias, o para una secuencia de aminoácidos sustancialmente igual que la secuencia de aminoácidos representada en la SEC ID N.º: 11.

7. El vector de acuerdo con la reivindicación 2, en el que la secuencia de ADN que codifica para la dihidrodipicolinato sintasa codifica para una secuencia de aminoácidos representada en la SEC ID N.º: 15 en el Listado de secuencias, o para una secuencia de aminoácidos sustancialmente igual que la secuencia de aminoácidos representada en la SEC ID N.º: 15.

8. El vector de acuerdo con la reivindicación 3, en el que la secuencia de ADN que codifica para la diaminopimelato descarboxilasa codifica para una secuencia de aminoácidos representada en la SEC ID N.º: 20 en el Listado de secuencias, o para una secuencia de aminoácidos sustancialmente igual a la secuencia de aminoácidos representada en la SEC ID N.º: 20.

9. El vector de acuerdo con la reivindicación 4, en el que dicha secuencia de ADN que codifica para la diaminopimelato deshidrogenasa codifica para una secuencia de aminoácidos representada en la SEC ID N.º: 24 en el Listado de secuencias, o para una secuencia de aminoácidos sustancialmente igual a la secuencia de aminoácidos representada en la SEC ID N.º: 24.

10. Una bacteria corineforme que comprende una secuencia de ADN potenciada que codifica para una aspartocinasa en la que la inhibición de retroalimentación por L-lisina y L-treonina está desensibilizada y que comprende una secuencia de ADN potenciada que codifica para una dihidrodipicolinato reductasa, en la que el ADN se potencia incrementando el número de copias de un gen, usando un promotor fuerte, o combinando estos medios.

11. La bacteria corineforme de acuerdo con la reivindicación 10, en la que dichos resultados de secuencia de ADN potenciada dan como resultado un incremento en la actividad intracelular de una enzima codificada por dicha secuencia de ADN incrementando el número de copias de un gen, usando un promotor fuerte, o combinando estos medios.

12. La bacteria corineforme de acuerdo con la reivindicación 10, en la que dicha secuencia de ADN potenciada da como resultado un incremento en la actividad intracelular de una enzima codificada por dicha secuencia de ADN incrementando el número de copias de un gen.

13. La bacteria corineforme de acuerdo con cualesquiera reivindicaciones 10-12, que comprenden adicionalmente una secuencia de ADN potenciada que codifica para una dihidrodipicolinato sintasa.

14. Las bacterias corineformes de acuerdo con la reivindicación 13, que comprenden adicionalmente una secuencia de ADN potenciada que codifica para una diaminopimelato descarboxilasa.

15. Las bacterias corineformes de acuerdo con la reivindicación 14, que comprenden adicionalmente una secuencia de ADN potenciada que codifica para una diaminopimelato deshidrogenasa.

16. Una bacteria corineforme transformada por introducción del vector según se define en una cualquiera de las reivindicaciones 1-4.

17. Un procedimiento para producir L-lisina que comprende las etapas de cultivar dicha bacteria corineforme según se define en una cualquiera de las reivindicaciones 10 a 16 en un medio apropiado, producir y acumular Llisina en un cultivo de la bacteria y recoger L-lisina del cultivo.

Figura 1

Figura 2

Figura 3

Figura 4

Figura 5

Figura 6

Figura 7

Figura 8

Figura 9

Figura 10

Figura 11

Figura 12

Figura 13

Figura 14


 

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