Procedimiento, conjunto de cebadores y kit para la detección del virus de la necrosis pancreática infecciosa (IPNV) en peces asintomáticos,

utilizando la combinación de RT-PCR, RT-PCR anidada e hibridación en dot-blot. Para la RT-PCR se han diseñado cebadores específicos que amplifican un fragmento de 599 pares de bases de la región del precursor de VP2. Para la RT-PCR anidada se han diseñado cebadores internos que amplifican un fragmento de 191 pb. Para la hibridación se ha diseñado una sonda de ADN bicatenario marcada con digoxigenina a partir de los productos purificados de la RT-PCR anidada. Se han establecido condiciones óptimas para los diferentes pasos de amplificación del ARN, así como para la hibridación en dot-blot. La invención permite detectar este virus en tejidos del pez, incluyendo muestras de sangre, de forma rápida, fiable y eficaz. El procedimiento descrito es de aplicación en el sector de la acuicultura.

Procedimiento, conjunto de cebadores y kit para la detección del virus de la necrosis pancreática infecciosa (IPNV) en peces asintomáticos.

Sector de la técnica

La presente invención se refiere a un conjunto de cebadores, procedimiento y kit para la detección del virus de la necrosis pancreática infecciosa (IPNV) en peces asintomáticos, más concretamente a la aplicación de un procedimiento no destructivo ni cruento que comprende la combinación de RT-PCR, RT-PCR anidada, e hibridación en dot-blot; a los cebadores empleados en dicho procedimiento; y al kit que permite la realización de dicho procedimiento. La presente invención es de aplicación en el sector de la acuicultura, y más particularmente en el control del estado de salud de peces, tanto de poblaciones naturales como cultivadas.

Estado de la técnica

La enfermedad de la necrosis pancreática infecciosa (IPN) es una patología vírica aguda, altamente contagiosa y de muy amplia distribución geográfica que afecta a peces cultivados y salvajes tanto de agua dulce como de ambientes marinos, así como a especies diádromas. Esta enfermedad, que puede cursar como brotes epizoóticos alcanzando alta tasa de morbilidad y mortalidad, ha sido descrita en los cinco continentes, siendo más frecuente en Europa, en el Lejano Oriente, y en América del Norte y Sur (Rodríguez et al., 2003. Adv. Virus Res., 62:113-165).

El agente causal de esta enfermedad se ha denominado IPNV, un virus perteneciente al género Aquabirnavirus, familia Birnaviridae. Este virus posee un virión icosaédrico desnudo con dos segmentos de ARN bicatenario como material genético. Las principales proteínas de la nucleocápside son la VP2 (proteína mayoritaria) y VP3 (proteína interna de la cápside) (Dobos, 1995. Ann. Rev. Dis., 5:25-54). El uso de técnicas inmunológicas ha demostrado la existencia de diversos serogrupos y serotipos dentro del IPNV, aunque estas técnicas no tipifican aislados de orígenes de peces marinos (Riji John and Richards, 1999. J. Gen. Virol., 80:2061-2065). Por estas razones, recientemente se han aplicado técnicas moleculares para la clasificación de los aquabirnavirus (Blake et al., 2001. Dis. Aquat. Org., 45:89-102). Se han establecido seis genoprupos (I a VI) comprendiendo 10 genotipos (I.1, I.2, II, III.1, II.2, IV.1, IV.2, V.1, V.2 y VI) basándose en los análisis de restricción (RFLP) y secuenciación del gen que codifica la proteína VP2 de la cápside del virus (Cutrin et al., 2004. Appl. Environ. Microbiol., 70:1059-1067). Posteriormente, se ha establecido un séptimo genogrupo (VII) en base a la secuencia de la región de unión entre los genes de VP2 y VP4 (Nishizawa et al., 2005. J. Gen. Virol., 86:1973-1978).

IPNV causa infecciones clínicas en alevines y juveniles de peces salvajes y cultivados, y los supervivientes de la infección pueden convertirse en portadores asintomáticos del virus (Imajoh et al., 2005. Fish Shellfish Immunol., 18:163-177). El método de análisis estándar recomendado por la Organización Mundial de Sanidad Animal (OIE) en 2003 se basa en los siguientes puntos:

1. Aislamiento del IPNV en cultivo celular a partir de los tejidos de peces enfermos. Identificación del IPNV aislado en cultivo celular, mediante neutralización con anticuerpos específicos o por inmunofluorescencia indirecta o por un enzimoinmunoensayo.

2. Detección directa del IPNV en tejidos de peces afectados por inmunofluorescencia indirecta, enzimoinmunoensayo, por coaglutinación o por inmunohistoquímica.

Como puede observarse, el método recomendado implica una destrucción de tejidos y muerte del pez analizado, y asimismo se requiere mucho tiempo para los análisis. Existe una demanda, por parte de empresas del sector de la Acuicultura, para el desarrollo de sistemas rápidos y eficaces de detección de IPNV y que eviten el sacrificio de peces con el objeto de establecer un plan de saneamiento de portadores inaparentes.

Los sistemas más efectivos de detección de microorganismos por métodos moleculares, que no requieren su cultivo, están basados en la reacción en cadena de la polimerasa (PCR) (Mullis y Faloona, 1987. Meth. Enzymol. 155: 335-350). La presente invención se refiere a un protocolo basado en técnicas de PCR para la detección del virus IPNV, así como los cebadores específicos para ello. Además, éste se combina con un protocolo de hibridación en dot-blot, utilizando una sonda de ADN bicatenario (ADNbc), para aumentar la sensibilidad de la técnica y como herramienta de confirmación de los productos de amplificación. Este método, al ser no destructivo, evitaría la consiguiente pérdida valiosa del cultivo de peces, como por ejemplo ejemplares reproductores.

Descripción detallada de la invención

El problema técnico planteado es lograr un método rápido y fiable que permita la detección específica de IPNV en muestras de sangre de peces. El procedimiento no destructivo propuesto se basa en la aplicación de dos técnicas moleculares, una RT-PCR anidada y una hibridación dot-blot para la detección del IPNV a partir de sangre de peces portadores inaparentes del virus. Para la RT-PCR se han diseñado cebadores específicos que amplifican un fragmento de 599 pares de bases (pb) de la región del precursor de VP2 (proteína mayoritaria de la cápside vírica) dentro del gen vírico que codifica la poliproteína. Para la RT-PCR anidada se han diseñado cebadores internos que amplifican un fragmento de 191 pb. Mediante esta técnica hemos conseguido detectar IPNV en menos de un día de trabajo y sin necesidad de realizar cultivos celulares de las muestras. A partir de este producto de amplificación de 191 pb, se ha diseñado una sonda de ADNbc marcada con digoxigenina para hibridar en dot-blot los productos obtenidos mediante las reacciones de RT-PCR y RT-PCR anidada.

De este modo, constituye un objeto de la presente invención un procedimiento para la detección del virus de la necrosis pancreática infecciosa (IPNV) en peces asintomáticos, incluyendo muestras de sangre, que comprende las siguientes etapas:

a. Extracción y purificación del ARN total de las muestras.

b. Amplificación mediante RT-PCR de una secuencia de 599 pb de la región del precursor de la proteína VP2 utilizando un conjunto de cebadores en el cual al menos dos de los cebadores de dicho conjunto presentan secuencias que comprenden SEQ ID NO 1 y SEQ ID NO 2. Preferentemente, dicho conjunto está formado por un primer cebador cuya secuencia comprende SEQ ID NO 1 y por un segundo cebador cuya secuencia comprende SEQ ID NO 2. Más preferentemente, la secuencia de nucleótidos del primer cebador es idéntica a SEQ ID NO 1 y la secuencia de nucleótidos del segundo cebador es idéntica a SEQ ID NO 2.

c. Amplificación de un fragmento de 191 pb de los productos resultantes de la primera amplificación mediante RT-PCR anidada utilizando un conjunto de cebadores en el cual al menos dos de los cebadores de dicho conjunto presentan secuencias que comprenden SEQ ID NO 3 y SEQ ID NO 4. Preferentemente, dicho conjunto está formado por un primer cebador cuya secuencia comprende SEQ ID NO 3 y por un segundo cebador cuya secuencia comprende SEQ ID NO 4. Más preferentemente, la secuencia de nucleótidos del primer cebador es idéntica a la SEQ ID NO 3 y la secuencia de nucleótidos del segundo cebador es idéntica a la SEQ ID NO 4.

d. Obtención de sondas de ADN bicatenario a partir de los productos resultantes de la segunda amplificación (RT-PCR anidada).

e. Hibridación en dot-blot de los productos resultantes de la segunda amplificación (RT-PCR anidada) usando las sondas de ADN bicatenario obtenidas en la etapa (d).

f. Detección de los productos hibridados mediante inmunoensayo.

Constituyen otro objeto de la presente invención los conjuntos de cebadores referidos anteriormente y empleados en las amplificaciones mediante RT-PCR y RT-PCR anidada.

Constituye otro objeto de la presente invención un kit para la detección del virus de la necrosis pancreática infecciosa (IPNV) en peces asintomáticos, incluyendo muestras de sangre, que comprende al menos unos conjuntos de cebadores tal y como los antes referidos.

Preferentemente el kit comprende:

a. Conjunto de cebadores para la amplificación mediante RT-PCR de una secuencia de 599 pb de la región del precursor de la proteína VP2 en el cual al menos dos de los cebadores de dicho conjunto presentan secuencias que comprenden SEQ ID NO 1 y SEQ ID NO 2; preferentemente, dicho conjunto está formado por un primer cebador cuya... [Seguir leyendo]

1. Conjunto de cebadores para la detección del virus de la necrosis pancreática infecciosa (IPNV) en peces asintomáticos caracterizado por que al menos dos de los cebadores de dicho conjunto presentan secuencias idénticas a SEQ ID NO 1 y SEQ ID NO 2.

2. Conjunto de cebadores para la detección del virus de la necrosis pancreática infecciosa (IPNV) en peces asintomáticos según la reivindicación anterior caracterizado por que dicho conjunto está formado por un primer cebador cuya secuencia es idéntica a SEQ ID NO 1 y por un segundo cebador cuya secuencia es idéntica a SEQ ID NO 2.

3. Conjunto de cebadores para la detección del virus de la necrosis pancreática infecciosa (IPNV) en peces asintomáticos caracterizado por que al menos dos de los cebadores de dicho conjunto presentan secuencias idénticas a SEQ ID NO 3 y SEQ ID NO 4.

4. Conjunto de cebadores para la detección del virus de la necrosis pancreática infecciosa (IPNV) en peces asintomáticos según la reivindicación anterior caracterizado por que dicho conjunto está formado por un primer cebador cuya secuencia es idéntica a SEQ ID NO 3 y por un segundo cebador cuya secuencia es idéntica a SEQ ID NO 4.

5. Procedimiento para la detección del virus de la necrosis pancreática infecciosa (IPNV) en peces asintomáticos que comprende: