Un polipéptido híbrido que comprende:

un motivo polipeptídico de una proteína priónica;

y

un armazón que comprende un anticuerpo o un fragmento del mismo que conserva al menos una porción de la unión específica del anticuerpo de longitud completa, en el que:

el motivo polipeptídico comprende al menos los restos 89-105, 89-112, 95-112, 121-131, 121-141, 121- 136, 121-144, 121-158, 87-112, 87-118, 87-130, 119-136, 126-158, 131-158, 136-158 ó 141-158 de un polipéptido priónico de hámster sirio que tiene una secuencia expuesta en la SEC ID Nº: 5, o los restos correspondientes de un prión de otra especie;

el armazón contiene al menos 10 restos aminoacídicos; y

el polipéptido híbrido se une a la forma de PrPSc de un polipéptido priónico

Polipéptidos híbridos con motivos injertados y usos de los mismos La materia objeto proporcionada en la presente memoria se realizó con ayuda del gobierno bajo el nº de subvención HL63817 concedida por el National Institutes of Health. El gobierno puede tener ciertos derechos en dicha materia objeto.

Solicitudes relacionadas

Beneficio de prioridad respecto a la solicitud de Estados Unidos provisional de Nº de Serie 60/371.610, presentada el9 de abril de 2002, titulada "POLIPEPTIDOS HÍBRIDOS CON MOTIVOS INJERTADOS QUE CONTIENEN LA INTERFAZ DE REPLICACIÓN DEL POLIPÉPTIDO PRIÓNICO CELULAR Y DE OTRAS ENFERMEDADES DE LA AGREGACIÓN DE PROTEÍNAS Y USOS DE LOS MISMOS" para R. Anthony Williamson, Dennis R. Burton y Gianluca Moroncini.

La materia objeto en la presente memoria está relacionada con la materia objeto en la solicitud PCT internacional Nº (nº de expediente 22908-1229PC) , presentada el mismo día con la presente, titulada "POLIPÉPTIDOS HÍBRIDOS CON MOTIVOS INJERTADOS QUE CONTIENEN LA INTERFAZ DE REPLICACIÓN DEL POLIPÉPTIDO PRIÓNICO CELULAR Y MOTIVOS DE OTRAS ENFERMEDADES DE LA CONFORMACIÓN DE PROTEÍNAS Y USOS DE LOS MISMOS".

Antecedentes

Las encefalopatías espongiformes transmisibles, incluyendo la enfermedad de Creutzfeldt-Jakob (CJD) de seres humanos y la encefalopatía espongiforme bovina (BSE; también conocida como Enfermedad de las Vacas Locas) y la tembladera de los animales (scrapie) , son enfermedades de demencia estrechamente relacionadas de vacas, ovejas, seres humanos y otros animales. La encefalopatía espongiforme bovina (BSE) , la tembladera de ovejas, el Kuru y la enfermedad de Creutzfeldt-Jakob (CJD) de seres humanos son sólo unos cuantos ejemplos de un grupo de trastornos neurodegenerativos denominados encefalopatías espongiformes transmisibles (TSE) ; están caracterizados por pérdida de control motor, demencia, parálisis, ceguera, desgaste y, en última instancia, muerte. Estas enfermedades pueden ser hereditarias o esporádicas. Un riesgo de contraer TSE para seres humanos es a través de productos alimenticios derivados de ganado bovino infectado con BSE. Otro riesgo de transmisión es una posible infección a través de sangre y productos sanguíneos humanos que tengan su origen en donantes infectados por TSE. Esta familia de enfermedades neurodegenerativas invariablemente mortales y la enfermedad del desgaste crónico (CWD) de ciervos y alces están causadas por priones (Prusiner et al. (1998) Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 95: 13363-13383) .

La proteína priónica corresponde al producto de un gen que se encuentra de forma natural en el genoma de todos los vertebrados desde seres humanos a peces. El gen está codificado típicamente por aproximadamente 771 nucleótidos que codifican 257 aminoácidos. Se expresa en muchos, pero no en todos, los tejidos de animales, siempre en la superficie externa de la membrana celular. Se han secuenciado los genes de más de 89 especies; también se han identificado y secuenciado mutaciones, incluyendo aquellas con inserciones y deleciones y otras alteraciones. Se ha detectado ácido nucleico relacionado con PrP en organismos tales como Drosophila, el nematodo Caenorhabditis elegans y levaduras.

El precursor de la proteína priónica (PrP o PrPc) es la isoforma celular normal de la proteína priónica. La proteína priónica infecciosa se denomina PrPSc, y la proteína priónica normal es la PrPc (la "sc" es por scrapie y la "c" por celular) . También se conocen formas truncadas y recombinantes. Por lo tanto, existen dos isoformas diferentes de la proteína priónica, una se expresa de forma normal y una está presente de forma anormal. La PrPSc es el componente principal de las placas amiloides que se encuentran a veces en los cerebros de ovejas infectadas con tembladera y en cerebros de seres humanos y otros animales infectados con enfermedades priónicas. Se cree que la conversión de PrPc en PrPSc implica la conversión de regiones alfa-helicoidales de la proteína en láminas beta. Las mutaciones asociadas con enfermedad priónica familiar aumentan la probabilidad de conversión; diferentes mutaciones dan como resultado diferentes síntomas de enfermedad. La CJD es una demencia, la GSS (Enfermedad de Gerstmann-Strassler-Scheinker) ataxia y el FFI (insomnio familiar fatal) .

Las formas heredadas de la enfermedad priónica constituyen aproximadamente el 25% de todos los casos de enfermedades priónicas en seres humanos, particularmente, GSS, CJD familiar y FFI. En cada una de las formas heredadas, se han encontrado mutaciones en la ORF (fase de lectura abierta) del gen de PRNP. La primera mitad de la ORF de PRNP contiene aproximadamente 170 pb con un alto contenido (aproximadamente el 80%) de los nucleótidos guanidina (G) y citidina (C) , la mayoría de esta secuencia está organizada en repeticiones de 24 pb (o 27 pb) . Se observan pocas diferencias entre estas secuencias y entre las de otras especies, sugiriendo que están altamente conservadas a través de la evolución. El gen se expresa predominantemente en células neuronales, así como en ganglios y nervios del sistema nervioso periférico. No se expresa exclusivamente en el sistema nervioso central (SNC) y neuronas, sino que también se expresa en otros tejidos, incluyendo riñón, corazón, pulmón y bazo.

Existen muchas mutaciones que se han identificado con la ORF de la PRNP y con frecuencia están genéticamente vinculadas a enfermedad priónica hereditaria. La proteína PrPc se expresa como una glicoproteína anclada a glicosil fosfatidil inositol que se encuentra en la membrana celular externa de las neuronas y en menor medida de linfocitos y otras células.

La transmisión entre especies está caracterizada por bajas tasas de transmisión o un tiempo de incubación largo. La BSE se ha transmitido a ratones, ovejas, cerdos y titís. La transmisión se caracteriza por la inducción de una forma alterada del producto génico del hospedador a través de su interacción con el componente homólogo del material infeccioso. Los ratones no se infectan por priones humanos, ni tampoco los ratones transgénicos que llevan una copia de PrP humana; sin embargo, los ratones transgénicos que llevan una PrP híbrida ratón/humano se infectan por priones humanos. Esto sugiere que es necesaria una interacción entre un factor del hospedador y la PrP para la transmisión, y que el factor de ratón no es suficientemente similar al factor humano para interaccionar con la PrP humana. La inclusión de algunas secuencias de ratón en la PrP de otro modo humana restauraba la interacción.

El único componente conocido del prión infeccioso es una isoforma anormal causante de enfermedad de la proteína priónica denominada PrPSc. Para distinguir la isoforma celular normal (PrPc) de la PrPSc en tejidos infectados, los inmunoensayos convencionales han dependido de la degradación proteolítica de la PrPr, seguida de la detección del núcleo resistente a proteasas de la PrPSc (denominada PrP 23-30) que es antigénicamente indistinguible de la PrPc (véase, por ejemplo, Oesch et al. (1985) Cell 40: 735-746; Prusiner (1999) en Prion Biology and Diseases (ed. S.B. Prusiner) , Cold Spring harbor Laborator y Press) .

La emergencia en Europa de una nueva forma variante de CJD (vCJD) está estrechamente asociada con la ingestión de carne contaminada con prión de BSE y ha aumentado las preocupaciones sobre el riesgo que representan los priones para la seguridad de los productos alimenticios y sanguíneos (Bruce et al. (1997) Nature 389: 498-501; Hill et al. (1997) Nature 389: 448-450) . Los estudios en ratones transgénicos que albergan PrP humana y bovina proporcionan pruebas de que los priones de ganado bovino infectado con BSE causan vCJD (Scott et al. (1999) Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 96: 15137-15142; Scott et al. (1997) Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 94: 14279-14284; y Hill et al. (1997) Nature 389: 448-450) . Son preocupaciones importantes de salud pública si los priones de CWD y BSE tienen características de cepa similares y si la CWD puede atravesar la barrera de especie a seres humanos (Horiuchi et al. (1999) Structure 7: R231-R240; Raymond et al. (1997) Nature 388: 285-288) . La ausencia de un ensayo de diagnóstico sensible para la infección por priones ha impedido una evaluación precisa de cuántos de los millones de individuos expuestos a priones de BSE están actualmente incubando la enfermedad (Aguzzi et al. (2001) Nat. Med. 7: 289-290) .

Se han desarrollado ensayos prototípicos de uso potencial en el diagnóstico de priones (véase, por ejemplo, Safer et al. (1998) Nat. Med 4: 1157-1165) . Por ejemplo, se ha desarrollado... [Seguir leyendo]

1. Un polipéptido híbrido que comprende:

un motivo polipeptídico de una proteína priónica; y un armazón que comprende un anticuerpo o un fragmento del mismo que conserva al menos una porción de la unión específica del anticuerpo de longitud completa, en el que:

el motivo polipeptídico comprende al menos los resto.

8. 105.

8. 112.

9. 112.

12. 131.

12. 141, 121136.

12. 144.

12. 158.

8. 112.

8. 118.

8. 130.

11. 136.

12. 158.

13. 158.

13. 158 .

14. 158 de un polipéptido priónico de hámster sirio que tiene una secuencia expuesta en la SEC ID Nº: 5, o los restos correspondientes de un prión de otra especie; el armazón contiene al menos 10 restos aminoacídicos; y el polipéptido híbrido se une a la forma de PrPSc de un polipéptido priónico.

2. El polipéptido híbrido de la reivindicación 1, que es multimérico.

3. El polipéptido híbrido de cualquiera de las reivindicaciones 1-2, que es un dímero.

4. El polipéptido híbrido de cualquiera de las reivindicaciones 1-3, que es un trímero.

5. El polipéptido híbrido de cualquiera de las reivindicaciones 1-4, en el que el motivo polipeptídico se inserta dentro del armazón.

6. El polipéptido híbrido de cualquiera de las reivindicaciones 1-5, en el que el armazón es una inmunoglobulina o un fragmento de la misma.

7. El polipéptido híbrido de cualquiera de las reivindicaciones 1-6, en el que el armazón incluye una región constante de una inmunoglobulina IgG, IgM, IgA, IgD o IgE.

8. El polipéptido híbrido de cualquiera de las reivindicaciones 1-7, en el que el armazón es un Fab, F (ab) 2 o Fv de cadena sencilla.

9. El polipéptido híbrido de cualquiera de las reivindicaciones 1-8, en el que el prión es de un animal seleccionado del grupo que consiste en seres humanos, hámsteres, ratones, ratas, ciervos, ovejas, cabras, alces, kudú, caballos, perros, gatos, camellos y cerdos.

10. El polipéptido híbrido de cualquiera de las reivindicaciones 1-9, en el que el prión está codificado por una forma mutante de un alelo codificante de prión.

11. El polipéptido híbrido de cualquiera de las reivindicaciones 1-10, en el que la porción priónica del polipéptido consiste esencialmente en los resto.

12. 131.

12. 141.

12. 136.

12. 144.

12. 158.

8. 112.

8. 118.

8. 130, 126158.

13. 158.

13. 158 .

14. 158 de un polipéptido priónico de hámster sirio que tiene una secuencia expuesta en la SEC ID Nº: 5, o los restos correspondientes de un prión de otra especie.

12. El polipéptido híbrido de cualquiera de las reivindicaciones 1-10, en el que la porción priónica del polipéptido consiste esencialmente en los resto.

13. 158.

8. 105.

8. 112 .

9. 112 de un polipéptido priónico de un polipéptido priónico de hámster sirio que tiene una secuencia expuesta en la SEC ID Nº: 5, o los restos correspondientes de un prión de otra especie.

13. El polipéptido híbrido de cualquiera de las reivindicaciones 1-10, que comprende los restos que incluyen al menos una hélice alfa de la forma de PrPc del prión.

14. El polipéptido híbrido de cualquiera de las reivindicaciones 1-7, en el que el armazón comprende el anticuerpo b12 (Número de Acceso de la ATCC 69079) o un fragmento del mismo.

15. El polipéptido híbrido de cualquiera de las reivindicaciones 1-7, en el que el armazón comprende el anticuerpo b12 (Número de Acceso de la ATCC 69079) o un fragmento en el mismo, en el que el motivo polipeptídico se inserta en lugar de los resto.

11. 131 de la SEC ID Nº: 4.

16. El polipéptido híbrido de cualquiera de las reivindicaciones 1-7, en el que:

el armazón comprende las cadenas pesada y ligera del anticuerpo b12 (Número de Acceso de la ATCC 69079) ; la cadena pesada comprende la secuencia de aminoácidos de la SEC ID Nº: 4; y la cadena ligera comprende la secuencia de aminoácidos de la SEC ID Nº: 2.

17. El polipéptido híbrido de cualquiera de las reivindicaciones 1-10, en el que:

el armazón es un polipéptido de inmunoglobulina o fragmento del mismo; y el motivo polipeptídico se inserta dentro de la tercera región determinante de complementariedad (CDR) de la molécula de inmunoglobulina.

18. El polipéptido híbrido de la reivindicación 17, que es un fragmento Fab.

19. El polipéptido híbrido de la reivindicación 17, que es una inmunoglobulina.

20. Una molécula de ácido nucleico que codifica el polipéptido híbrido de cualquiera de las reivindicaciones 1-19.

21. Un vector, que comprende la molécula de ácido nucleico de la reivindicación 20.

22. El vector de la reivindicación 21, que es un vector de expresión.

23. El vector de la reivindicación 21, que es un vector eucariota.

24. El vector de la reivindicación 21, que incluye una secuencia de nucleótidos que dirige la secreción de cualquier polipéptido codificado por una secuencia de nucleótidos unida operativamente a la misma.

25. El vector de la reivindicación 21, que es un vector de mamífero, un vector de levadura o un vector bacteriano.

26. El vector de la reivindicación 21, que es un vector viral, un vector de Pichia o un vector de E. coli.

27. Una célula, que comprende un vector de la reivindicación 21.

28. La célula de la reivindicación 27, que es una célula procariota.

29. La célula de la reivindicación 27, que es una célula eucariota.

30. La célula de la reivindicación 27, que se selecciona de entre una célula bacteriana, una célula de levadura, una célula vegetal, una célula de insecto y una célula de animal.

31. La célula de la reivindicación 27, que es una célula de mamífero.

32. Un método de detección de una forma de PrPSc de un polipéptido priónico, que comprende:

poner en contacto una muestra sospechosa de contener una isoforma infecciosa de un polipéptido priónico con un polipéptido híbrido de cualquiera de las reivindicaciones 1-19; detectar la unión a cualquier PrPSc en la muestra.

33. El método de la reivindicación 32, en el que la muestra es un fluido corporal, un tejido u órgano.

34. El método de la reivindicación 32, en el que el prión es un prión de animal seleccionado del grupo que consiste en seres humanos, hámsteres, ratones, ratas, ciervos, ovejas, cabras, alces, kudú, caballos, perros, gatos, camellos y cerdos.

35. El método de la reivindicación 32, en el que la muestra es un fluido corporal que se selecciona del grupo que consiste en sangre, orina, sudor, saliva, líquido cefalorraquídeo, muestras de esperma, suero, plasma y líquido sinovial.

36. El método de la reivindicación 32, en el que el polipéptido híbrido está marcado de forma detectable.

37. El método de la reivindicación 32, en el que el armazón comprende toda o una porción de una enzima, un anticuerpo o una molécula fluorescente o cromogénica.

38. Un soporte sólido que comprende una pluralidad de polipéptidos híbridos de cualquiera de las reivindicaciones 1

19.

39. Un método de detección de células que contienen una forma de PrPSc de un polipéptido priónico, que comprende:

poner en contacto células de un animal o tejido con un polipéptido híbrido de cualquiera de las reivindicaciones 1-19, en el que el polipéptido híbrido está marcado de forma detectable o comprende un armazón detectable; y detectar las células marcadas in vitro.

40. El método de la reivindicación 39, en el que el marcador es un marcador fluorescente.

41. El método de la reivindicación 40, en el que la detección se efectúa por citometría de flujo o citometría de

barrido. 5

42. El método de la reivindicación 39, en el que las células se ponen en contacto con una pluralidad de polipéptidos híbridos diferentes.

43. El método de la reivindicación 42, en el que los polipéptidos híbridos se unen a distintos epítopos en un 10 polipéptido diana.

44. El método de la reivindicación 39, en el que el polipéptido híbrido comprende un armazón detectable.

45. El método de la reivindicación 44, en el que el armazón detectable comprende una proteína luminiscente o una 15 porción luminiscente de la misma.

46. El método de la reivindicación 45, en el que la proteína luminiscente es una proteína fluorescente (FP) .

47. El método de la reivindicación 46, en el que la FP se selecciona del grupo que consiste en una FP verde, una FP 20 roja, una FP azul y variantes de las mismas que tienen espectros de emisión distintos.

48. El método de la reivindicación 39, en el que las células son células infectadas por priones.

º Como se presentan aquí, todas las secuencias se alinearon con la secuencia de SHa. Sólo para los hámsteres los números son correctos a lo largo de toda la secuencia.

º La secuencia humana tiene una deleción en el aminoácido 228. La numeración proporcionada aquí está aumentada en 1 a partir de este punto.

º Las secuencias de ratón tienen una deleción en el aminoácido 55 y una inserción en 232/3. La numeración proporcionada aquí está aumentada en 1 entre estos puntos.

º Las secuencias de oveja y bovino tienen varias inserciones y deleciones; en la región central equivalente a SH.

9. 228, la numeración proporcionada aquí está disminuida en 3 (11para la secuencia bovina con la octarrepetición adicional) .

º La octarrepetición adicional en la secuencia bovina (SUBRAYADA) es un polimorfismo no patógeno que no siempre aparece.

FIG. 2