Método para la gamma-carboxilación de un polipéptido dependiente de la vitamina K en una célula huésped que comprende la introducción en dicha célula huésped de un ácido nucleico que codifica VKORC1 de manera que el ácido nucleico que codifica VKORC1 se exprese de forma recombinante en dicha célula,

caracterizado porque el ácido nucleico que codifica VKORC1 codifica:

a) una secuencia polipeptídica seleccionada de entre el grupo consistente en la SEQ ID NO: 12 y la SEQ ID NO: 17;

b) una secuencia polipeptídica de un alelo de la secuencia polipeptídica definida en (a);

c) una secuencia polipeptídica que tiene al menos un 90% de identidad con la secuencia polipeptídica definida en (a) o (b), donde la secuencia polipeptídica tiene actividad de VKORC1; y

d) una secuencia polipeptídica de un fragmento de la secuencia polipeptídica definida en (a), (b) o (c) que tiene actividad de VKORC1, donde la expresión de dicho VKORC1 en dicha célula huésped incrementa la actividad basal del VKORC1 de dicha célula huésped, y donde dicho método no es un método para el tratamiento del cuerpo humano o animal por cirugía o terapia

Polipéptido vkorc1 de reciclaje de la vitamina k-epóxido, una diana terapéutica de la cumarina y sus derivados.

Campo de la Invención

La invención se refiere a métodos para la gamma-carboxilación de un polipéptido dependiente de la vitamina K en una célula huésped que comprende la introducción dentro de dicha célula huésped de un ácido nucleico que codifica VKORC1 de modo tal que el ácido nucleico que codifica VKORC1 se exprese de forma recombinante en dicha célula. Además, la presente invención se refiere a las utilizaciones de un ácido nucleico de VKORC1 recombinante para la gamma-carboxilación de un polipéptido dependiente de la vitamina K en una célula huésped.

Antecedentes de la Invención

La represión de la coagulación sanguínea prematura es la opción terapéutica seleccionada para el tratamiento agudo y la prevención a largo plazo de eventos trombóticos. De entre los anticoagulantes, las cumarinas se utilizan ampliamente para la prevención de la trombosis, por ejemplo en pacientes inmovilizados después de una cirugía, en pacientes con insuficiencia cardíaca crónica, en pacientes con enfermedad vascular ateroesclerótica, en pacientes con tumores malignos y en mujeres embarazadas. Además, las cumarinas son los anticoagulantes orales más utilizados para el tratamiento y la profilaxis de la trombosis [Suttie, 1987]. Las cumarinas son derivados típicos de 6-hidroxicumarina, por ejemplo 3- (acetonilbencil) -4-hidroxicumarina (COUMADIN®) .

Las cumarinas tienen como objetivo la cascada de coagulación sanguínea indirectamente mediante la inhibición del ciclo de la vitamina K.

La vitamina K es un cofactor esencial para la activación post-traducción por la gamma-carboxilación de un grupo de proteínas reguladoras, las proteínas Gla. En diversas vías metabólicas, algunas proteínas clave necesitan una carboxilación para funcionar adecuadamente. La cascada de coagulación sanguínea es el ejemplo mejor estudiado. Aquí, los factores procoagulantes II, VII, IX y X, así como los factores anticoagulantes proteína C, proteína S, proteína Z, dependen de la gamma-carboxilación. Esta modificación post-traducción permite la fijación de las proteínas modificadas -en presencia de calcio- a las membranas fosfolipídicas bicapa, lo que representa una etapa esencial en la activación de la coagulación sanguínea [Sperling y col., 1978]; [Esmon y col., 1975]. Otras proteínas que requieren de la gammacarboxilación son la proteína de matriz gla y la osteocalcina, ambas reguladoras del metabolismo óseo [Price, 1988] y "el gen específico de la inhibición del crecimiento", una proteína señal de transducción del ciclo celular [Manfioletti y col., 1993]; [Stitt y col., 1995].

Durante la gamma-carboxilación se introduce un grupo carboxilo en los residuos glutamato de las proteínas diana mediante la enzima gamma-glutamil carboxilasa (GGCX) en los microsomas del hígado [Furie & Furie, 1988]; [Suttie, 1987]. La reacción requiere como cofactor cantidades estequiométricas de vitamina K1-hidroquinona reducida (vitamina K1H2) , que se oxida a vitamina K-2, 3-epóxido [Cain y col., 1997]. La regeneración del cofactor activo es mediada por un complejo multiproteína denominado vitamina K-2, 3-epóxido reductasa (VKOR) [Wallin & Martin, 1985]. El mismo complejo es el objetivo de los venenos de tipo cumarina utilizados en el control plaguicida de roedores. Este "ciclo de la vitamina K" se ha caracterizado bioquímicamente de forma detallada, pero los componentes moleculares no han sido purificados todavía hasta homogeneidad [Guenthner y col., 1981]. Además, la naturaleza molecular de la actividad de la cumarina y las moléculas que interactúan con las cumarinas siguen siendo imprecisas.

En general se aprecia en la técnica que, a pesar de su gran eficacia, existen diversas limitaciones al uso de las cumarinas. En primer lugar, algunos seres humanos son insensibles al tratamiento con cumarina. El término resistencia a la warfarina (WR) se utiliza para individuos que mantienen actividades normales del factor de coagulación a pesar de la anticoagulación oral con cumarinas (Acceso OMIM Nº 122700) . Se ha observado una transmisión autosómica dominante en varios linajes [O'Reilly y col., 1964]; [O'Reilly, 1970]. La deficiencia combinada de todos los factores de coagulación dependientes de la vitamina K (VKCFD) es un trastorno de sangrado muy raro en humanos con herencia autosómica recesiva, 14 casos descritos hasta la fecha [McMillan & Roberts, 1966]; [Fischer, 1966]; [Johnson y col., 1980]; [Goldsmith y col., 1982]; [Vicente y col., 1984]; [Ekelund y col., 1986]; [Pauli y col., 1987]; [Leonard, 1988]; [Pechlaner y col., 1992]; [Boneh & Bar-Ziv, 1996]; [Brenner y col., 1998]; [Spronk y col., 2000]; [Oldenburg y col, 2000]. Los síntomas clínicos de la enfermedad incluyen episodios de hemorragias intracerebrales perinatales, a veces con resultado fatal. Habitualmente, la tendencia al sangrado se invierte por completo mediante la administración oral de vitamina K. Los síntomas adicionales en recién nacidos se asemejan a la embriopatía por warfarina con hipoplasia falangiana nasal y distal y calcificación prematura de la epífisis [Pauli y col., 1987]. La enfermedad puede resultar de una resorción/transporte defectuoso de la vitamina K al hígado [Prentice, 1985] o de mutaciones en uno de los genes implicados en la gamma-carboxilación. En el subtipo 1 (VKCFD1, OMIM # 277450) , las mutaciones en el gen GGCX sobre el cromosoma 2p12 resultan en una carboxilación insuficiente de los factores de coagulación [Brenner y col., 1998]; [Spronk y col., 2000]. Se ha descrito una conexión de dos familias con la deficiencia múltiple familiar del factor de coagulación (FMFD, ahora renombrado: VKCFD2, OMIM # 607473) a un intervalo de 20 Mb de la región pericéntrica del cromosoma 16p12-q21 [Fregin y col., 2002]. Los pacientes con VKCFD2 mostraron niveles en suero notablemente en aumento de vitamina K-epóxido, sugiriendo así un defecto en una de las subunidades del complejo VKOR. En su conjunto, es evidente que existen pacientes que presentan resistencia a la warfarina. Como consecuencia, existe la

necesidad de identificar nuevos derivados de cumarinas que sean anticoagulantes eficaces para tratar a estos pacientes, así como métodos para identificar estos derivados de la cumarina.

El uso de cumarinas se asocia con un riesgo de sangrado espontáneo, con un índice de mortalidad significativo. Además, la predicción de la dosis exacta de mantenimiento de la cumarina es difícil. En ausencia de la molécula diana sobre la que la cumarina ejerce un efecto, el régimen de tratamiento debe establecerse en base a cada paciente. Mientras el régimen óptimo no se ha establecido todavía, el paciente tiene un mayor riesgo de trombogénesis o de sangrado. Por tanto, es necesario un método para determinar el régimen óptimo de tratamiento lo más rápido y seguro posible. Además, el establecimiento de un régimen de tratamiento óptimo se complica por el hecho de que existe un retraso considerable entre la administración de las cumarinas y el desencadenamiento de su actividad anticoagulante. Dada la acción retardada de la cumarina y considerando el hecho de que la cumarina tiende a acumularse con el tiempo, existe la necesidad de derivados de cumarina que permitan la coagulación sanguínea de forma más rápida que las cumarinas conocidas en la técnica. De la misma manera, existe también la necesidad de cumarinas que se metabolicen más rápidamente, de forma que se pueda impedir o mejorar la acumulación de cumarina y, consecuentemente, reducir o suprimir el riesgo de sobredosis.

Se entenderá que cuando el tratamiento con cumarina se inicia durante un estado trombótico, los niveles de proteína C y S disminuyen, creando así temporalmente un potencial trombogénico que normalmente es compensado superponiendo la administración de heparina y cumarina durante varios días. De nuevo, se necesita identificar la diana molecular de acción de la cumarina con el fin de poder buscar nuevos derivados de cumarina que no tengan estas limitaciones o al menos las tengan en menor medida.

A veces, la terapia con cumarina provoca necrosis de la piel en los pacientes y, cuando se aplica durante el embarazo, puede causar embriopatía, creando la necesidad de nuevos derivados de cumarina que no provoquen estos efectos.

Existen diversas interacciones entre los medicamentos y las cumarinas. Algunos de estos medicamentos, como el Fenobarbital, inducen niveles plasmáticos más bajos de las cumarinas debido a la mayor metabolización de la cumarina,... [Seguir leyendo]

1. Método para la gamma-carboxilación de un polipéptido dependiente de la vitamina K en una célula huésped que comprende la introducción en dicha célula huésped de un ácido nucleico que codifica VKORC1 de manera que el ácido nucleico que codifica VKORC1 se exprese de forma recombinante en dicha célula, caracterizado porque el ácido nucleico que codifica VKORC1 codifica:

a) una secuencia polipeptídica seleccionada de entre el grupo consistente en la SEQ ID NO: 12 y la SEQ ID NO: 17;

b) una secuencia polipeptídica de un alelo de la secuencia polipeptídica definida en (a) ;

c) una secuencia polipeptídica que tiene al menos un 90% de identidad con la secuencia polipeptídica definida en (a) o (b) , donde la secuencia polipeptídica tiene actividad de VKORC1; y d) una secuencia polipeptídica de un fragmento de la secuencia polipeptídica definida en (a) , (b) o (c) que tiene actividad de VKORC1, donde la expresión de dicho VKORC1 en dicha célula huésped incrementa la actividad basal del VKORC1 de dicha célula huésped, y donde dicho método no es un método para el tratamiento del cuerpo humano o animal por cirugía o terapia.

2. Método para la gamma-carboxilación de un polipéptido dependiente de la vitamina K en una célula huésped que comprende la introducción en dicha célula huésped de un ácido nucleico que codifica VKORC1 de manera que el ácido nucleico que codifica VKORC1 se exprese de forma recombinante en dicha célula, caracterizado porque el ácido nucleico que codifica VKORC1 codifica:

(a) una secuencia polipeptídica seleccionada de entre el grupo consistente en la SEQ ID NO: 12 y la SEQ ID NO: 17;

(b) una secuencia polipeptídica de un alelo de la secuencia polipeptídica definida en (a) ;

(c) una secuencia polipeptídica que tiene al menos un 90% de identidad con la secuencia polipeptídica definida en

(a) o (b) , donde la secuencia polipeptídica tiene actividad de VKORC1; y

(d) una secuencia polipeptídica de un fragmento de la secuencia polipeptídica definida en (a) , (b) o (c) que tiene actividad de VKORC1,

donde la expresión de dicho VKORC1 en dicha célula huésped incrementa la actividad basal del VKORC1 de dicha célula huésped y donde dicha célula es una célula seleccionada de entre el grupo consistente en células HEK293-EBNA, células de E. coli, hepatocitos primarios, células de levadura, células de insectos, células COS, líneas celulares de hepatocitos, y células madre embrionarias no humanas.

3. Método según la reivindicación 1 ó 2, caracterizado porque dicha proteína dependiente de la vitamina K se selecciona de entre el grupo consistente en factor de coagulación sanguínea II, VII, IX, X, proteína C, proteína S, proteína Z, proteína de matriz gla y osteocalcina.

4. Método según la reivindicación 1 ó 2, caracterizado porque dicho ácido nucleico que codifica VKORC1 se expresa en combinación con un ácido nucleico que codifica para la gamma-glutamil-carboxilasa.

5. Método según la reivindicación 1 ó 2, caracterizado porque dichas células que expresan dicho VKORC1 tienen una actividad basal incrementada de VKORC1 que aumenta aproximadamente en un 15% o más en comparación con la actividad basal de VKORC1 de dicha célula en ausencia de la expresión recombinante de dicho VKORC1 en tal célula huésped.

6. Utilización de un ácido nucleico recombinante de VKORC1 que codifica una secuencia polipeptídica seleccionada de entre el grupo consistente en:

a) una secuencia polipeptídica seleccionada del grupo consistente en una secuencia de acuerdo con las SEQ ID NO: 12 y 17;

b) una secuencia polipeptídica de un alelo de la secuencia polipeptídica definida en (a) ;

c) una secuencia polipeptídica con al menos un 90% de identidad con la secuencia polipeptídica definida en (a) o (b) , donde la secuencia polipeptídica tiene actividad de VKORC1; y d) una secuencia polipeptídica de un fragmento de la secuencia polipeptídica definida en (a) , (b) o (c) con actividad de VKORC1, para la gamma-carboxilación de un polipéptido dependiente de la vitamina K en una célula huésped, donde la expresión de dicho VKORC1 en dicha célula huésped incrementa la actividad basal de VKORC1 y donde dicha utilización no es una utilización para el tratamiento del cuerpo humano o animal mediante cirugía o terapia.

7. Utilización de un ácido nucleico recombinante de VKORC1 que codifica una secuencia polipeptídica seleccionada de entre el grupo consistente en:

(a) una secuencia polipeptídica seleccionada del grupo consistente en una secuencia de acuerdo con las SEQ ID NO: 12 y 17;

(b) una secuencia polipeptídica de un alelo de la secuencia polipeptídica definida en (a) ;

(c) una secuencia polipeptídica con al menos un 90% de identidad con la secuencia polipeptídica definida en (a) o (b) , donde la secuencia polipeptídica tiene la actividad de VKORC1; y

(d) una secuencia polipeptídica de un fragmento de la secuencia polipeptídica definida en (a) , (b) o (c) con la actividad de VKORC1,

para la gamma-carboxilación de un polipéptido dependiente de la vitamina K en una célula huésped, donde la expresión de dicho VKORC1 en dicha célula huésped incrementa la actividad basal de VKORC1 y donde dicha célula es una célula seleccionada de entre el grupo consistente en células HEK293-EBNA, células de E. coli, hepatocitos primarios, células de levadura, células de insectos, células COS, líneas celulares de hepatocitos y células madre embrionarias no humanas.

8. Utilización según la reivindicación 6 ó 7, caracterizada porque dicho polipéptido dependiente de la vitamina K se selecciona de entre el grupo consistente en factor de coagulación sanguínea II, VII, IX, X, proteína C, proteína S, proteína Z, proteína de matriz gla y osteocalcina.

9. Utilización según la reivindicación 6 ó 7, caracterizada porque dicho ácido nucleico de VKORC1 se utiliza en combinación con un ácido nucleico que codifica para la gamma-glutamil-carboxilasa.

10. Utilización según la reivindicación 6 ó 7, caracterizada porque dichas células que expresan dicho VKORC1 tienen una actividad basal incrementada de VKORC1 que aumenta aproximadamente en un 15% o más en comparación con la actividad basal de VKORC1 de dicha célula en ausencia de la expresión recombinante de dicho VKORC1 en tal célula huésped.