Péptidos que reducen los niveles de glucosa en sangre.

Un conjugado peptídico que comprende un péptido X seleccionado entre GLP-1 (7-36) y GLP-1 (7-37),

que tiene al menos una modificación seleccionada del grupo que consiste en:

(i) sustitución de la alanina en la posición 8 por D-alanina, glicina o ácido alfa-amino-isobutírico; y

(ii) un sustituyente lipófilo;

en el que el péptido X está acoplado por medio de su terminal N o C a una secuencia de aminoácidos Z, donde Z tiene la secuencia (Lys)n, en la que n es un número entero en el intervalo de 4 a 15; o

una sal farmacéuticamente aceptable o una amida C-terminal de dicho conjugado peptídico

Peptidos que reducen los niveles de glucosa en sangre Campo de la invención La presente invención se refiere a nuevos peptidos agonistas de la actividad del GLP-1. Mas especificamente la invención se refiere a conjugados peptidicos que comprenden variantes del GLP-1, que son farmacológicamente activos y estables, y como agonistas de la actividad de GLP-1 son utiles en el tratamiento de enfermedades que se benefician de la regulación de los niveles excesivos de glucosa en sangre y/o de la regulación del vaciado gastrico, tales como la diabetes y los trastornos alimenticios. La presente invención se refiere tambien a metodos para preparar dichos peptidos, a una composición, por ejemplo una composición farmaceutica, que comprende un peptido de la invención y un vehiculo fisiológicamente aceptable, y a dicho peptido para uso en terapia.

Antecedentes de la invención Varias hormonas que reducen los niveles de glucosa en sangre se liberan de la mucosa gastrointestinal en respuesta a la presencia y absorción de nutrientes en el intestino. Estas hormonas incluyen gastrina, secretina, polipeptido insulinotr6pico dependiente de la glucosa (GIP) y peptido 1 similar al glucag6n (GLP-1) . La sustancia mas potente conocida es el GLP-1 (0rskov, 1992, Diabetologia 35: 701-711) . El peptido 1 similar al glucag6n (GLP1) es un producto del proglucag6n, un peptido de 180 aminoacidos (Drucker, 1998, Diabetes 47: 159-169) . La secuencia total del proglucag6n contiene la secuencia de 29 aminoacidos del glucag6n, la secuencia de 36 o 37 aminoacidos del GLP-1 y la secuencia de 34 aminoacidos del peptido 2 similar al glucag6n (GLP-2) , un peptido intestinotrófico. El GLP-1 tiene varias funciones. Es una hormona fisiológica que aumenta el efecto sobre la secreción de insulina en los seres humanos normales y es por lo tanto una hormona incretina. Ademas, el GLP-1 reduce tambien las concentraciones de glucag6n, ralentiza el vaciado gastrico, estimula la biosintesis de (pro) insulina, y aumenta la sensibilidad a la insulina (Nauck, 1997, Horm. Metab. Resp. 47: 1253-1258) . El peptido aumenta tambien la capacidad de las celulas β para percibir y responder a la glucosa en sujetos con alteración de la tolerancia a la glucosa. (Byrne, 1998, Eur. J. Clin. Invest. 28: 72-78) . El efecto insulinotr6pico del GLP-1 en los seres humanos incrementa la velocidad de desaparición de la glucosa en parte debido al aumento de los niveles de insulina y en parte debido al aumento de la sensibilidad a la insulina (D'Alessio, 1994, Eur. J. Clin. Invest. 28: 72-8) . Esto ha situado al GLP-1 como un agente prometedor para el tratamiento de la diabetes tipo II. Se ha encontrado que los fragmentos activos del GLP-1 son el GLP-1 (7-36) y el GLP-1 (7-37) . Sin embargo, un problema farmacológico importante con el GLP-1 natural es su corta semivida. En los seres humanos y en las ratas, el GLP-1

se degrada rapidamente por la dipeptidil peptidasa-IV (DPP-IV) hasta GLP-1 (9-36) amida, que actua como un antagonista del receptor de GLP-1 end6geno (Deacon, 1998, Diabetologia 41: 271-278) . Se han propuesto varias estrategias que evitan este problema, algunas usan inhibidores de DPP-IV y otras, analogos de GLP-1 (7-36) amida resistentes a DPP-IV (Deacon, 1998, Diabetologia 41: 271-278; Deacon et al., 1998, Diabetes 47: 764-769; Ritzel, 1998, J. Endocrinol. 159: 93-102; Patente de EE.UU. N° 5.545.618; Pederson, 1998, Diabetes 47: 1253-1258) .

Las exendinas, otro grupo de peptidos que reducen los niveles de glucosa en sangre, tienen cierta similitud de secuencia (53 %) con GLP-1[7-36]NH2 (Goke et al. 1993, J.Biol. Chem. 268: 19650-55) . Las exendinas se encuentran en el veneno de Helodermatidae o lagartos de cuentas (Raufman, 1996, Reg. Peptidos 61: 1-8) . La exendina-3 esta presente en el veneno de Heloderma horridum, el lagarto de cuentas mexicano y la exendina-4 esta presente en el veneno de Heloderma suspectrum, el monstruo de Gila. La exendina-4 difiere de la exendina-3 sólo en las posiciones dos y tres. Se ha clonado y secuenciado el cDNA que codifica la proteina precursora de exendina4, un peptido de 47 aminoacidos fusionado al amino terminal de la exendina-4 (Pohl et al., 1998, J. Biol. Chem. 273: 9778-9784 y el documento W098/35033) . Tanto la exendina-3 como la exendina-4, estimulan un aumento en la producción de cAMP celular en las celulas acinares pancreaticas del conejillo de Indias por interacción con receptores de exendina (Raufman, 1996, Reg. Peptides 61: 1-18) . La exendina-3 causa un incremento bifasico en la 45 producción de cAMP celular, pero un incremento monofasico en la liberación de amilasa en las celulas acinares pancreaticas. En cambio, la exendina-4 causa un incremento monofasico en la producción de cAMP y no altera la liberación de amilasa.

La exendina-4 es un fuerte agonista del receptor de GLP-1 en celulas de insulinomas de rata aisladas (Goke et al. 1993, J. Biol. Chem. 268: 19650-55) . Esto es previsible porque el dominio (His Ala) del GLP-1 reconocido por la 50 DPP-IV no esta presente en la exendina-4 (Goke et al., 1993, J. Biol. Chem. 268: 19650-55) . La unión de [125I]GLP-1 al nucleo del tracto solitario se inhibi6 en dependencia de la concentración mediante GLP-1 no marcado y [Tyr39]exendina-4 con valores de Ki de 3, 5 y 9, 4 nM, respectivamente, y se encuentran valores similares en lineas celulares (Goke et al., 1995, Eur. J. Neurosci. 7: 2294-2300 y Goke et al. 1993, J. Biol. Chem. 268: 19650-55) . Ademas, la exendina-4 administrada sistemicamente reduce los niveles de glucosa en sangre en un 40 % en ratones 55 diabeticos db/db (documento W099/07404) . Recientemente, Grieg et al. (1999, Diabetologia 42: 45-50) han demostrado un efecto de larga duración en la reducción de los niveles de glucosa en sangre con una inyección diaria intraperitoneal de exendina-4 a ratones diabeticos ob/ob . La patente de EE.UU. N° 5.424.286 describe que una porción considerable de la secuencia N-terminal es esencial para conservar la actividad insulinotr6pica (exendina4 (1-31) e y31-exendina-4 (1-31) ) mientras que una exendina con el extremo N-terminal truncado (exendina-4 (9-39) )

60 tiene propiedades inhibitorias.

Se ha propuesto el uso de exendina-3, exendina-4 y agonistas de exendina para el tratamiento de la diabetes mellitus, por reducción de la motilidad gastrica y retraso del vaciado gastrico, y para la prevención de la hiperglucemia (Patente de EE.UU. N° 5.424.286, documento W098/05351) asi como para la reducción de la ingesta de alimentos (documento W098/30231) . Se han propuesto formas de obtener nuevos compuestos modificando las secuencias de la exendina natural. Una forma es incorporar sustituyentes lip6filos a la molecula, por ejemplo, como se describe en el documento W0 99/43708 que describe derivados de exendina con un sólo sustituyente lip6filo incorporado al residuo de aminoacido C-terminal.

Una aproximación importante ha sido disefar analogos de exendina caracterizados por sustituciones de aminoacidos y/o por el truncamiento en C-terminal de la secuencia de exendina-4 natural. Esta aproximación se representa por los compuestos de los documentos W099/07404, W099/25727 y W099/25728.

El documento W099/07404 describe los agonistas de exendina que tienen una fórmula general I que define una secuencia peptidica de 39 residuos de aminoacidos con Gly Thr en las posiciones 4-5, Ser Lys Gln en las posiciones 11-13, Glu Glu Glu Ala Val Arg Leu en las posiciones 15-21, Leu Lys Asn Gly Gly en las posiciones 26-30, Ser Ser Gly Ala en las posiciones 32-35, y en la que las posiciones restantes pueden estar ocupadas por residuos de aminoacidos de la exendina natural o pueden estar ocupadas por sustituciones de aminoacidos especificos. La fórmula I no incluye ningun agonista de exendina ni analogos que tengan deleciones de aminoacidos especificos y/o que esten conjugados como se describe en la presente memoria, tales como los nuevos compuestos desPro36exendina-4 (1-39) , exendina-4 (1-39) -k6 o desPro36-exendina-4 (1-39) -K6.

El documento W0 99/25727 describe agonistas de exendina que tienen una fórmula general I que define una secuencia peptidica de 28 a 38 residuos de aminoacidos con Gly en la posición 4 y Ala en la posición 18, y en la que las posiciones restantes pueden estar ocupadas por residuos de aminoacidos de la exendina natural o pueden estar ocupadas por sustituciones de aminoacidos especificos. La fórmula I no comprende una secuencia peptidica que tenga Ser como aminoacido C-terminal ni agonistas o analogos de exendina que tengan deleciones de aminoacidos especificos y/o que esten conjugados como se describe en la presente memoria, tales como los nuevos compuestos desPro36-exendina-4 (1-39) , exendina-4... [Seguir leyendo]

1. Un conjugado peptidico que comprende un peptido X seleccionado entre GLP-1 (7-36) y GLP-1 (7-37) , que tiene al menos una modificación seleccionada del grupo que consiste en:

(i) sustitución de la alanina en la posición 8 por D-alanina, glicina o acido alfa-amino-isobutirico; y

(ii) un sustituyente lip6filo;

en el que el peptido X esta acoplado por medio de su terminal N o C a una secuencia de aminoacidos Z, donde Z tiene la secuencia (Lys) n, en la que n es un numero entero en el intervalo de 4 a 15; o una sal farmaceuticamente aceptable o una amida C-terminal de dicho conjugado peptidico.

2. El conjugado peptidico segun la reivindicación 1, en el que el peptido X se caracteriza ademas por ser eficaz para mejorar la tolerancia a la glucosa en un mamifero diabetico.

3. El conjugado peptidico de la reivindicación 1 o reivindicación 2, en el que la relación entre la dosis minima eficaz de dicho conjugado peptidico y la dosis oral minima eficaz del peptido X es al menos 1:5.

4. El conjugado peptidico segun una cualquiera de las reivindicaciones precedentes, en el que el sustituyente lip6filo es un grupo palmitoilo unido al grupo epsilon-amino de una Lys en el peptido X.

5. El conjugado peptidico segun una cualquiera de las reivindicaciones precedentes, en el que X se selecciona del grupo que consiste en Gly8-GLP-1- (7-36) (Humano) -NH2, Gly8-GLP-1- (7-36) (Humano) , Gly8Lys37 (palmitoil) -GLP-1- (736) (Humano) , Gly8Lys34 (palmitoil) -GLP-1- (7-36) (Humano) , y los acidos libres o amidas primarias de C-terminal y las sales farmaceuticamente aceptables de los mismos.

6. El conjugado peptidico segun una cualquiera de las reivindicaciones precedentes, en el que dicho peptido X se selecciona del grupo que consiste en un GLP-1 (7-36) -NH2 que tiene al menos una modificación seleccionada del grupo que consiste en la sustitución de alanina por glicina en la posición 8 y un grupo palmitoilo lip6filo unido a una lisina en la posición 26, 34 o 37, y el acido libre y una de sus sales farmaceuticamente aceptables.

7. El conjugado peptidico segun una cualquiera de las reivindicaciones precedentes, en el que el sustituyente lip6filo esta unido al grupo epsilon-amino de una Lys en dicho GLP-1.

8. El conjugado peptidico segun una cualquiera de las reivindicaciones precedentes, en el que X esta unido a Z mediante un enlace peptidico.

9. El conjugado peptidico segun una cualquiera de las reivindicaciones precedentes, en el que la carga total de la secuencia peptidica (Z) esta en el intervalo de 0 a +15 a pH 7, preferiblemente en el intervalo de 0 a +10, tal como en el intervalo de 0 a +8, mas preferiblemente en el intervalo de 0 a +7 o de 0 a +6.

10. El conjugado peptidico segun una cualquiera de las reivindicaciones precedentes, en el que n es un numero entero en el intervalo de 4 a 10, tal como en el intervalo de 4 a 8, por ejemplo en el intervalo de 4 a 7.

11. El conjugado peptidico segun una cualquiera de las reivindicaciones precedentes, en el que Z es Lys6 o Lys7.

12. El conjugado peptidico segun la reivindicación 1, en el que Z esta representado por Lys8 unido al C-terminal de

X.

13. El conjugado peptidico segun una cualquiera de las reivindicaciones precedentes, en el que dichos residuos de aminoacidos tienen una configuración L.

14. El conjugado peptidico segun la reivindicación 1, en el que dicho conjugado se selecciona del grupo que consiste en:

Gly8-GLP-1 (7-36) -Lys8-NH2, Lys8-Gly8-GLP-1 (7-36) -Lys6-NH2, Lys8-Gly8-GLP-1 (7-36) -NH2, Gly8-Lys37 (palmitoil) -GLP-1 (7-36) (Humano) -Lys7-NH2, Gly8-lys28 (palmitoil) -GLP-1 (7-36) (Humano) -Lys8-NH2, Gly8-Lys34 (palmitoil) -GLP-1 (7-36) (Humano) -Lys8-NH2, Gly8-GLP-1 (7-36) -Lys8-NH2, Gly8-GLP-1 (7-36) -Lys10-NH2, y Gly8-GLP-1 (7-37) -Lys8-NH2, o uno de sus acidos libres y una de sus sales farmaceuticamente aceptables.

15. El conjugado peptidico segun la reivindicación 1, que comprende X, un agonista peptidico de la actividad de GLP-1 en el que X se selecciona del grupo que consiste en:

Gly8-GLP-1 (7-36) -NH2, y Gly8-GLP-1 (7-36) , y en el que X esta unido en el C-terminal por un enlace peptidico a una secuencia peptidica Z seleccionada del grupo que consiste en (Lys) n en la que n es un numero entero de 4 a 8, preferiblemente n es 6, y el acido libre del mismo y una de sus sales farmaceuticamente aceptables.

16. Un conjugado farmaceuticamente activo segun una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 15, para uso en terapia.

17. Una composición farmaceutica que comprende un conjugado peptidico farmaceuticamente activo segun una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 15, y un vehiculo farmaceuticamente aceptable.

18. La composición farmaceutica segun la reivindicación 17, en la que el conjugado peptidico activo se selecciona del grupo que consiste en Gly8-GLP-1 (7-36) -Lys7-NH2, Gly8-GLP-1 (7-36) -Lys7-NH2, y el acido libre del mismo y una de sus sales farmaceuticamente aceptables.

19. Un metodo para producir los conjugados peptidicos segun una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 15, que comprende

a) introducir una secuencia de acido nucleico que codifica una secuencia polipeptidica que comprende la secuencia peptidica de dicho conjugado peptidico y un marcador seleccionable contenido en una construcción de acido nucleico o un vector dentro de una celula hospedante para obtener una celula hospedante recombinante; b) seleccionar dicha celula hospedante recombinante; c) cultivar dichas celulas hospedantes recombinantes en condiciones que permiten la producción de dicha secuencia polipeptidica; d) aislar dicha secuencia polipeptidica del cultivo; y e) desanclar opcionalmente dicha secuencia polipeptidica utilizando una proteasa apropiada para obtener dicho conjugado peptidico.

20. Una secuencia de acido nucleico que codifica un conjugado peptidico segun una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 15.

21. Un conjugado peptidico segun una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 15, para uso en terapia.

22. El uso de un conjugado peptidico farmaceuticamente activo segun una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 15, en la fabricación de un medicamento para el tratamiento de la diabetes tipo 1 o tipo 2, sindrome de resistencia a la insulina, obesidad, trastornos alimenticios, hiperglucemia, trastornos metabólicos, y enfermedad gastrica.

23. El uso de un conjugado peptidico farmaceuticamente activo segun una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 15, para la fabricación de un medicamento para el tratamiento de enfermedades asociadas con niveles elevados de glucosa en sangre provocados por hormonas de las que se sabe que hacen aumentar los niveles de glucosa en sangre, tales como las catecol-aminas incluyendo la adrenalina, los glucocorticoides, la hormona del crecimiento y el glucag6n.

24. El uso de un conjugado peptidico farmaceuticamente activo segun una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 15, para la fabricación de un medicamento para la regulación de los niveles de glucosa en sangre.

25. El uso de un conjugado peptidico farmaceuticamente activo segun una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 15, para la fabricación de un medicamento para la regulación del vaciado gastrico.

26. El uso de un conjugado peptidico farmaceuticamente activo segun una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 15, para la fabricación de un medicamento para reducir la mortalidad y morbilidad despues de un infarto de miocardio.