Un análogo del péptido 2 tipo glucagón (GLP-2) representado por la fórmula general:

R 1 -Z 1 -His-Gly-Gly-X3-X5-FA-X7-Ser-Glu-X10-X11-Thr-Ile-Leu-Asp-X16-Leu-Ala-Ala-Arg-Asp-Phe-Ile-X24-Trp-Leu­ Ile-X28-Thr-Lys-X31-X32-X33-Z 2 -R 2 en donde: R 1 es hidrógeno, alquilo C1-4 (por ejemplo, metilo), acetilo, formilo, benzoilo o trifluoroacetilo X3 es Glu o Asp X5 es Ser o Thr X7 es Ser o Thr X10 es Met, Leu, Nle, o un aminoácido sustituto de la Met oxidativamente estable X11 es Asn, Ala, Lys o Ser X16 es Asn o Ala X24 es Asn o Ala X28 es Gln o Ala X31 es Ile o está eliminado X32 es Thr o está eliminado X33 es Asp o está eliminado R 2 es NH2 u OH; Z 1 y Z 2 están ausentes o son independientemente una secuencia de péptidos de 3-20 aminoácidos seleccionados del grupo constituido por Ala, Leu, Ser, Thr, Tyr, Asn, Gln, Asp, Glu, Lys. Arg, His, Met y Om; o una de sus sales farmacéuticamente aceptables

Campo de la invención

La presente invención se refiere a análogos del péptido 2 tipo glucagón (GLP-2) y a su uso médico, por ejemplo en la profilaxis o el tratamiento de trastornos relacionados con el estómago y el intestino y para la mejora de los efectos secundarios de la quimioterapia y la radioterapia.

Antecedentes de la invención

El GLP-2 es un péptido de 33 aminoácidos liberado tras el procesamiento post-traduccional del glucagón en las células L enteroendocrinas del intestino y en regiones específicas del tronco cerebral. Es cosecretado junto con el péptido 1 tipo glucagón (GLP-1), la oxintomodulina y la glicentina, en respuesta a la ingestión de nutrientes.

El GLP-2 induce un crecimiento significativo del epitelio de la mucosa del intestino delgado a través de la estimulación de la proliferación de blastocitos en las criptas y la inhibición de la apoptosis en las vellosidades (Drucker y col. Proc Natl Acad Sci USA. 1996, 93:7911-6). El GLP-2 también inhibe el vaciado gástrico y la secreción de ácidos gástricos (Wojdemann y col. J Clin Endocrinol Metab. 1999, 84:2513-7), mejora la función de la barrera intestinal (Benjamin y col. Gut. 2000, 47:112-9), estimula el transporte de hexosa intestinal mediante la regulación por aumento de los transportadores de glucosa (Cheeseman, Am J. Physiol. 1997, R 1965-71), e incrementa el flujo sanguíneo intestinal (Guan y col. Gastroenterology. 2003, 125, 136-47).

El GLP-2 se une a un único receptor acoplado a la proteína G que pertenece a la familia de las secretinas del glucagón de clase II (1). El receptor del GLP-2 sólo ha sido localizado en el intestino delgado, en el colon y en el estómago, sitios que se sabe que son sensibles al GLP-2 (Yusta y col. Gastroenterology. 2000, 119: 744-55). Sin embargo, la célula diana para la estimulación del receptor del GLP-2 en el tracto gastrointestinal sigue sin estar clara y los mediadores intracelulares aguas abajo acoplados al receptor del GLP-2 se conocen poco.

Los efectos beneficiosos y específicos demostrados del GLP-2 en el intestino delgado han despertado mucho interés, como el uso del GLP-2 en el tratamiento de una enfermedad o lesión intestinal (Sinclair and Drucker, Physiology 2005: 357-65). Además, se ha demostrado que el GLP-2 previene o reduce el daño epitelial de la mucosa en un gran número de modelos preclínicos de lesión de las vísceras, incluyendo mucositis inducida por quimioterapia, lesión de isquemia-reperfusión, colitis inducida por dextrano sulfato y modelos genéticos de la enfermedad inflamatoria del intestino (Sinclair and Drucker Physiology 2005: 357-65).

El GLP-2 se secreta en forma de péptido de 33 aminoácidos con la siguiente secuencia: H-His-Ala-Asp-Gly-Ser-Phe-Ser-Asp-Glu-Met-Asn-Thr-Ile-Leu-Asp-Asn-Leu-Ala-Ala-Arg-Asp-Phe-lle-Asn-Trp-Leu-Ile-Gln-Thr-Lys-Ile-Thr-Asp-OH. Se escinde rápidamente por la alanina (A) en posición 2 del extremo NH2 al GLP-2 (3-33) humano inactivo mediante la enzima DPP IV. Esta rápida degradación enzimática del GLP-2 (1-33), además del aclaramiento renal da como resultado una semi-vida para el péptido de 7 minutos aproximadamente (Tavares y col., Am. J. Physiol. Endocrinol. Metab. 278:E134-E139, 2000).

En el documento US 5.994.500 (Drucker y col.) se describen antagonistas del GLP-2 y sus efectos sobre el crecimiento del tejido gastrointestinal. Se sugiere que los antagonistas se formulen en forma de compuestos farmacéuticos para su uso en el tratamiento de la hiperplasia o para inducir hipoplasia. En el documento US

5.994.500 la estructura del GLP-2 de mamífero ha sido alterada por mutaciones, tales como sustituciones y eliminaciones.

Los documentos US 6.184.208; US 5.789.379 y US 6.184.201 describen análogos del GLP-2 y sus usos médicos. Todos los análogos se obtienen por sustituciones y/o eliminaciones del GLP-2 humano.

DaCambra y col. (Biochemistry 2000, 39, 8888-8894) describe los determinantes estructurales para la actividad del GLP-2. Ejemplos de dichos determinantes son la Phe6 y la Thr5, que son mencionados como cruciales para la unión y activación del receptor del GLP-2.

En el documento WO 97/39031, se describe el análogo del GLP-2, el [Gly2]GLP-2. Aquí, la alanina en posición 2 ha sido sustituida por glicina para hacer que el péptido sea resistente a la escisión con DPP IV. La sustitución de la alanina ha demostrado incrementar la estabilidad y potencia del péptido. La solicitud de patente describe cómo se puede usar el análogo del GLP-2 contra enfermedades asociadas a la inflamación y destrucción de la mucosa epitelial del intestino. Éstas incluyen la resección masiva del intestino delgado, enfermedad inflamatoria del intestino, mucositis inducida por quimioterapia y lesión isquémica.

El documento WO 02/066511 describe análogos del GLP-2 que tienen una semi-vida in vivo prolongada y su uso como medicamentos en el tratamiento de trastornos gastrointestinales, como enfermedades inflamatorias del intestino.

**(Ver fórmula)**

El documento WO 01/41779 describe el uso de h[Gly2]GLP-2 como pretratamiento para inhibir la apoptosis inducida por quimioterapia y promover la supervivencia celular.

El uso del GLP-2 o análogos del GLP-2 en el tratamiento de diversas enfermedades ha sido propuesto por muchos científicos. No obstante, aún existe la necesidad de análogos del GLP-2 mejorados y estables.

Resumen de la invención

De manera amplia, la presente invención se refiere a análogos del GLP-2 que comprenden una o más sustituciones comparados con el GLP-2 de tipo natural y que tienen la propiedad de una actividad biológica in vivo mejorada y/o una estabilidad química mejorada, por ejemplo, como se evalúa en ensayos de estabilidad in vitro.

Específicamente, la invención proporciona un análogo del péptido 2 tipo glucagón (GLP-2) representado por la fórmula general:

R1-Z1-His-Gly-X3-Gly-XS-Phe-X7-Ser-Glu-X10-X11-Thr-Ile-Leu-Asp-X16-Leu-Ala-Ala-Arg-Asp-Phe-Ile-X24-Trp-LeuIle-X28-Thr-Lys-X31-X32-X33-Z2-R2 donde: R1 es hidrógeno, alquilo C1-4 (por ejemplo, metilo), acetilo, formilo, benzoilo o trifluoroacetilo X3 es Glu o Asp X5 es Ser o Thr X7 es Ser o Thr X10 es Met, Leu, Nle, o un aminoácido sustituto de la Met oxidativamente estable X11 es Asn, Ala, Lys o Ser X16 es Asn o Ala X24 es Asn o Ala X28 es Gln o Ala X31 es Ile o está eliminado X32 es Thr o está eliminado X33 es Asp o está eliminado R2 es NH2 u OH; Z1 y Z2 están ausentes o son independientemente una secuencia de péptidos de 3-20 aminoácidos seleccionados del grupo constituido por Ala, Leu, Ser, Thr, Tyr, Asn, Gln, Asp, Glu, Lys, Arg, His, Met y Om;

o una de sus sales farmacéuticamente aceptables.

En ciertas formas de realización, cuando Z1 está presente R1 puede ser H, y cuando Z2 está presente R2 puede ser OH.

En algunas formas de realización de la presente invención, el análogo del GLP-2 tiene una identidad de secuencia de aminoácidos de al menos el 63% con el GLP-2 de tipo natural (1-33) que tiene la secuencia expuesta en la introducción de la solicitud, más preferentemente una identidad de secuencia de al menos el 66% y aún más preferentemente una identidad de secuencia de al menos el 69%.

"Identidad de secuencia de aminoácidos del tanto por ciento (%)" con respecto a las secuencias del polipéptido GLP-2 se define como el porcentaje de restos de aminoácidos en una secuencia candidata que son idénticos a los restos de aminoácidos en la secuencia GLP-2 de tipo natural, después de alinear las secuencias e introducir huecos, si fuera necesario, para conseguir el máximo porcentaje de identidad de secuencia, y sin considerar ninguna sustitución conservativa como parte de la identidad de secuencia. El alineamiento de las secuencias se puede llevar a cabo por personas expertas usando técnicas muy conocidas en la materia, por ejemplo, usando programa informático disponible para el público tal como el programa informático BLAST, BLAST2

o Align, véase:

Altschul y col. (Methods in Enzymology, 266:480-480 (1996); http://blast.wustl/edu/blast/README.html) o Pearson y col. (Genomics, 46, 24, 36, 1997) y http://molbiol.soton.ac.uk/compute/align.html para el programa Align.

El porcentaje de identidad de secuencia usado en el presente documento y según la presente invención se determina usando estos programas informáticos con sus ajustes por defecto. De manera más general, la persona experta... [Seguir leyendo]

1. Un análogo del péptido 2 tipo glucagón (GLP-2) representado por la fórmula general: R1-Z1-His-Gly-Gly-X3-X5-FA-X7-Ser-Glu-X10-X11-Thr-Ile-Leu-Asp-X16-Leu-Ala-Ala-Arg-Asp-Phe-Ile-X24-Trp-LeuIle-X28-Thr-Lys-X31-X32-X33-Z2-R2 en donde: R1 es hidrógeno, alquilo C1-4 (por ejemplo, metilo), acetilo, formilo, benzoilo o trifluoroacetilo X3 es Glu o Asp X5 es Ser o Thr X7 es Ser o Thr X10 es Met, Leu, Nle, o un aminoácido sustituto de la Met oxidativamente estable X11 es Asn, Ala, Lys o Ser X16 es Asn o Ala X24 es Asn o Ala X28 es Gln o Ala X31 es Ile o está eliminado X32 es Thr o está eliminado X33 es Asp o está eliminado R2 es NH2 u OH; Z1 y Z2 están ausentes o son independientemente una secuencia de péptidos de 3-20 aminoácidos seleccionados del grupo constituido por Ala, Leu, Ser, Thr, Tyr, Asn, Gln, Asp, Glu, Lys. Arg, His, Met y Om;

o una de sus sales farmacéuticamente aceptables.

2. El análogo del GLP-2 de la reivindicación 1, en donde el análogo del GLP-2 tiene una identidad de secuencia de aminoácidos de al menos el 63% con el GLP-2 (1-33) de tipo natural y tiene la actividad biológica que provoca un incremento de la masa intestinal in vivo.

3. El análogo del GLP-2 de la reivindicación 1 o la reivindicación 2, en donde el análogo del GLP-2 comprende además una sustitución con respecto a la secuencia del GLP-2 de tipo natural en una o más de las posiciones X16, X24 y X28 y, opcionalmente, una sustitución con respecto a la secuencia del GLP-2 de tipo natural en una o más de las posiciones de X3, X5, X7, X10 y X11.

4. El análogo del GLP-2 de la reivindicación 3, en donde dicha sustitución en la posición X10 es Leu, Nle,

o un aminoácido sustituto de la Met oxidativamente estable, tal como Met(O) o Met(O)2.

5. El análogo del GLP-2 de la reivindicación 4, en donde dicha sustitución en la posición X11 es Ala, Ser

o Lys.

6. El análogo del GLP-2 de la reivindicación 2, en donde el análogo del GLP-2 comprende uno o más de los siguientes grupos de sustituciones: Ala16 Ala24 Ala28 Ala16, Ala24 Ala16, Ala28 Ala24, Ala28 Ala16, Ala24, Ala28

7. El análogo del GLP-2 de la reivindicación 3, en donde el análogo del GLP-2 comprende uno o más de los siguientes grupos de sustituciones: Glu3, Thr5, Leu10, Lys11, Ala16, 24, 28 Glu3, Thr5, Ser11, Leu10, Ala16, 24, 28 Glu3, Ser11, Leu10, Ala16, 24, 28 Glu3, Thr5, Leu10, Ala11, 16, 24, 28 Glu3, Leu10, Ala11, 16, 24, 28 Thr7, Leu10, Ser11, Ala24 Thr7, Leu10, Ala11, 24 Thr7, Leu10, Lys11, Ala24 Leu10, Ala11, 24 Leu10, Ser11, Ala24, o una eliminación en una o más de las posiciones X31-X33.

8. El análogo del GLP-2 de una de cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en donde el análogo del GLP-2 comprende una sustitución con respecto al GLP-2 de tipo natural en las posiciones X3 y/o X24.

9. El análogo del GLP-2 de la reivindicación 1, que es: 1846 H-HGEGSFSSELSTILDALAARDFIAWLIATKITDKKKKKK-NH2,

**(Ver fórmula)**

o una de sus sales farmacéuticamente aceptables.

10. El análogo del GLP-2 de la reivindicación 1, que es: 1848 H-HGEGTFSSELATILDALAARDFIAWLIATKITDKKKKKK-NH2,

o una de sus sales farmacéuticamente aceptables.

11. El análogo del GLP-2 de la reivindicación 1, que es: 1818 H-HGDGSFSSELATILDNLAARDFIAWLIQTKKKKKKK-NH2; 1820 H-HGDGSFTSELATILDNLAARDFIAWLIQTKKKKKKK-NH2; 1823 H-HGDGSFTSELKTILDNLAARDFIAWLIQTKKKKKKK-NH2; 1825 H-HGDGSFSSELATILDNLAARDFIAWLIQTK-NH2; 1828 H-HGDGSFTSELSTILDNLAARDFIAWLIQTKKKKKKK-NH2; 1829 H-HGDGSFSSELSTILDNLAARDFIAWLIQTKKKKKKK-NH2; 1832 H-HGDGSFTSELSTILDNLAARDFIAWLIQTK-NH2; 1833 H-HGDGSFSSELSTILDNLAARDFIAWLIQTK-NH2; 1834 H-HGDGSFTSELATILDNLAARDFIAWLIQTK-NH2; 1842 H-HGDGSFTSELKTILDNLAARDFIAWLIQTK-NH2; 1844 H-HGEGTFSSELSTILDALAARDFIAWLIATKITDKKKKKK-NH2; 1849 H-HGEGSFSSELATILDALAARDFIAWLIATKITDKKKKKK-NH2; 1852 H-HGEGTFSSELKTILDALAARDFIAWLIATKITDKKKKKK-NH2; 1853 H-HGEGTFSSELSTILDALAARDFIAWLIATKITD-NH2; 1855 H-HGEGSFSSELSTILDALAARDFIAWLIATKITD-NH2; 1857 H-HGEGTFSSELATILDALAARDFIAWLIATKITD-NH2; 1858 H-HGEGSFSSELATILDALAARDFIAWLIATKITD-NH2; 1861 H-HGEGTFSSELKTILDALAARDFIAWLIATKITD-NH2;

o una de sus sales farmacéuticamente aceptables.

12. Un análogo del GLP-2 de una cualquiera de las reivindicaciones precedentes para su uso en terapia.

13. Una composición farmacéutica que comprende un análogo del GLP-2 de una cualquiera de las reivindicaciones anteriores, o una de sus sales, en mezcla con un vehículo.

14. La composición farmacéutica de la reivindicación 13, en donde el análogo del GLP-2 es una sal de adición de ácido farmacéuticamente aceptable.

15. La composición farmacéutica de la reivindicación 13 o reivindicación 14, que está formulada como un líquido adecuado para su administración mediante inyección o infusión, o que está formulada para provocar la liberación lenta de dicho análogo del GLP-2.

16. El uso de un análogo del GLP-2 de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 11 para la preparación de un medicamento para el tratamiento y/o prevención de un trastorno relacionado con el estómago y el intestino.

17. El uso de la reivindicación 16, en donde el trastorno relacionado con el estómago y el intestino son úlceras, gastritis, trastornos digestivos, síndromes de malabsorción, síndrome del intestino corto, síndrome del fondo de saco, enfermedad inflamatoria del intestino, esprúe celíaco (por ejemplo, derivados de la enteropatía inducida por gluten o enfermedad celíaca), esprúe tropical, esprúe hipogammaglobulinémico, enteritis, enteritis regional (enfermedad de Crohn), colitis ulcerosa, síndrome del intestino irritable asociado a diarrea, daño del intestino delgado y síndrome del intestino corto.

18. El uso de la reivindicación 16, en donde el trastorno relacionado con el estómago y el intestino es enteritis por radiación, enteritis infecciosa o post-infecciosa, o daño del intestino delgado debido a agentes quimioterapéuticos u otros tóxicos.

19. El uso de un análogo del GLP-2 de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 11 para la preparación de un medicamento para el tratamiento y/o prevención de un efecto secundario de la quimioterapia o la radioterapia.

20. El uso de la reivindicación 19, en donde el efecto secundario es diarrea, calambres abdominales o

vómitos debidos a la quimioterapia, o daños estructurales y funcionales del epitelio intestinal como resultado de la quimioterapia o la radiación.

21. El uso de un análogo del GLP-2 de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 11 para la preparación de un medicamento para el tratamiento de la función intestinal comprometida en neonatos, la osteoporosis o dolencias mediadas por la DPP-IV (dipeptidilpeptidasa-IV).

22. El uso de un análogo del GLP-2 de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 11 para la preparación de un medicamento para el tratamiento y/o prevención de una dolencia que implica la desnutrición.

23. El uso de la reivindicación 22, en donde la dolencia que implica desnutrición es la caquexia o la anorexia.

24. Una molécula de ácido nucleico que comprende una secuencia de ácido nucleico que codifica un análogo del GLP-2 de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 11.

25. Un vector de expresión que comprende la secuencia de ácido nucleico de la reivindicación 24, en combinación con secuencias de control para dirigir su expresión.

26. Una célula hospedadora transformada con el vector de expresión de la reivindicación 25.

27. Un procedimiento para producir el análogo del GLP-2 de cualquiera de las reivindicaciones 1 a 11, el procedimiento que comprende el cultivo de las células hospedadoras de la reivindicación 26 en condiciones adecuadas para expresar los análogos del GLP-2 y la purificación de los análogos del GLP-2 así producidos.

28. Una molécula de ácido nucleico según la reivindicación 24, un vector de expresión según la reivindicación 25, o una célula hospedadora según la reivindicación 26, para su uso en la terapia.

29. El uso de una molécula de ácido nucleico según la reivindicación 24, un vector de expresión según la reivindicación 25, o una célula hospedadora según la reivindicación 26, en la preparación de un medicamento para el tratamiento y/o prevención de un trastorno relacionado con el estómago y el intestino, o para el tratamiento y/o prevención de un efecto secundario de la quimioterapia o la radioterapia, o para el tratamiento de la función intestinal comprometida en neonatos, la osteoporosis o dolencias mediadas por la DPP-IV (dipeptidilpeptidasa-IV).

30. Un análogo de GLP-2 según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 11, una molécula de ácido nucleico según la reivindicación 24, un vector de expresión según la reivindicación 25, o una célula hospedadora según la reivindicación 26, para su uso en un procedimiento para el tratamiento y/o la prevención de un trastorno relacionado con el estómago y el intestino, para el tratamiento y/o prevención de un efecto secundario de la quimioterapia o la radioterapia, o para el tratamiento de la función intestinal comprometida en neonatos, la osteoporosis o dolencias mediadas por la DPP-IV (dipeptidilpeptidasa-IV).

31. El análogo del GLP-2, la molécula de ácido nucleico, el vector de expresión, o la célula hospedadora para su uso en un procedimiento para el tratamiento o la prevención según la reivindicación 30, en donde el trastorno relacionado con el estómago y el intestino son úlceras, gastritis, trastornos digestivos, síndromes de malabsorción, síndrome del intestino corto, síndrome del fondo de saco, enfermedad inflamatoria del intestino, esprúe celíaco (por ejemplo, derivados de la enteropatía inducida por gluten o enfermedad celíaca), esprúe tropical, esprúe hipogammaglobulinémico, enteritis, enteritis regional (enfermedad de Crohn), colitis ulcerosa, síndrome del intestino irritable asociado a diarrea, daño del intestino delgado y síndrome del intestino corto.

32. El análogo del GLP-2, la molécula de ácido nucleico, el vector de expresión, o la célula hospedadora para su uso en un procedimiento para el tratamiento o la prevención según la reivindicación 30, en donde el trastorno relacionado con el estómago y el intestino es enteritis por radiación, enteritis infecciosa o post-infecciosa, o daño del intestino delgado debido a agentes quimioterapéuticos u otros tóxicos.

33. Un análogo del GLP-2 de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 11, una molécula de ácido nucleico según la reivindicación 24, el vector de expresión según la reivindicación 25, o la célula hospedadora según la reivindicación 26, para su uso en un procedimiento para el tratamiento o prevención de un efecto secundario de la quimioterapia o la radioterapia.

34. El análogo del GLP-2, la molécula de ácido nucleico, el vector de expresión, o la célula hospedadora para su uso en un procedimiento para el tratamiento o prevención según la reivindicación 33, en donde el efecto secundario es diarrea, calambres abdominales o vómitos debidos a la quimioterapia, o daños estructurales y

funcionales del epitelio intestinal como resultado de la quimioterapia o la radiación.

35. Un análogo del GLP-2 de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 11, una molécula de ácido nucleico según la reivindicación 24, el vector de expresión según la reivindicación 25, o la célula hospedadora según

**(Ver fórmula)**

**(Ver fórmula)**

5 la reivindicación 26, para su uso en un procedimiento para el tratamiento de la función intestinal comprometida en neonatos, la osteoporosis o dolencias mediadas por la DPP-IV (dipeptidilpeptidasa-IV).

36. Un kit terapéutico que comprende un fármaco para quimioterapia contra el cáncer y un análogo del GLP-2 según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 11, una molécula de ácido nucleico según la reivindicación 24, un vector de expresión según la reivindicación 25, o una célula hospedadora según la reivindicación 26, cada uno opcionalmente en combinación con un vehículo farmacéuticamente aceptable.

37. Una composición farmacéutica que comprende un fármaco para quimioterapia contra el cáncer y un análogo del GLP-2 según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 11, una molécula de ácido nucleico según la reivindicación 24, un vector de expresión según la reivindicación 25, o una célula hospedadora según la reivindicación 26, en combinación con un vehículo farmacéuticamente aceptable.