NUEVAS ENTIDADES BIOLÓGICAS Y EL USO DE LAS MISMAS.

Un procedimiento para generar una enzima proteolítica que tenga especificidad definida no conferida por el armazón proteico para al menos un sustrato diana que comprende al menos las siguientes etapas:

(a) proporcionar un armazón proteico que tenga al menos 70 % de homología con tripsina humana I que tenga la secuencia de aminoácidos mostrada en SEC ID Nº: 1, que catalice al menos una reacción química en al menos un sustrato, (b) generar una biblioteca de enzimas proteolíticas o enzimas proteolíticas aisladas combinando un polinucleótido que codifica el armazón proteico de la etapa (a) mediante inserción o sustitución con 1 a 11 regiones determinantes de especificidad (SDR), en la que las SDR son secuencias oligonucleotídicas sintéticas completa o parcialmente aleatorias que codifican secuencias peptídicas con una longitud de menos de 50 restos aminoacídicos en una o más posiciones del grupo de posiciones dentro del polinucleótido que codifica el armazón proteico que corresponde estructuralmente o por homología de secuencia de aminoácidos a las regiones 18-25, 38-48, 54-63, 73-86, 122-130, 148-156, 165-171 y 194-204 en tripsina humana I que tiene la secuencia de aminoácidos mostrada en SEC ID Nº: 1, expresar dichas enzimas y (c) seleccionar de la biblioteca de enzimas proteolíticas generada en la etapa (b) una o más enzimas que tengan especificidades definidas no conferidas por el armazón proteico proporcionado en la etapa (a) para al menos un sustrato diana

Nuevas entidades biológicas y el uso de las mismas La presente divulgación proporciona enzimas obtenidas por ingeniería genética comprendidas por un armazón proteico y Regiones Determinantes de Especificidad, la producción de tales enzimas y el uso de las mismas para fines terapéuticos, de investigación, de diagnóstico, de cuidado nutricional, de cuidado personal e industriales.

Antecedentes La investigación académica e industrial busca continuamente proteínas funcionales para usarlas como agentes terapéuticos, de investigación, de diagnóstico, nutricionales, de cuidado personal o industriales. En la actualidad, tales proteínas funcionales pueden clasificarse principalmente en dos categorías: proteínas naturales y proteínas obtenidas por ingeniería. Las proteínas naturales, por un lado, se descubren en la naturaleza, por ejemplo cribando aislados naturales o secuenciando genomas de diversas especies. Las proteínas obtenidas por ingeniería genética, por otro lado, se basan normalmente en proteínas conocidas y se alteran para adquirir funcionalidades modificadas. En el presente documento se desvelan proteínas obtenidas por ingeniería genética con nuevas funciones en comparación con los componentes de partida. Tales proteínas se denominan NBE (Nuevas Entidades Biológicas) . Las NBE desveladas son enzimas obtenidas por ingeniería genética con nuevas especificidades de sustrato o proteínas de fusión de tales enzimas obtenidas por ingeniería genética con otros componentes funcionales.

La especificidad es un elemento esencial de la función enzimática. Una célula consiste en miles de catalizadores altamente reactivos diferentes. Aún así la célula es capaz de mantener un metabolismo coordinado y una estructura tridimensional altamente organizada. Esto se debe en parte a la especificidad de las enzimas, es decir la conversión selectiva de sus sustratos respectivos. La especificidad es una propiedad cualitativa y cuantitativa: la especificidad de una enzima particular puede variar ampliamente, variando de solamente un tipo particular de moléculas diana a todos los tipos moleculares con ciertas subestructuras químicas. En la naturaleza, la especificidad de las enzimas de un organismo ha evolucionado a tenor de las necesidades particulares del organismo. Es poco probable encontrar especificidades arbitrarias con alto valor para aplicaciones terapéuticas, de investigación, de diagnóstico, nutricionales o industriales en el repertorio enzimático de cualquier organismo debido al gran espacio de posibles especificidades. El único modo realista de obtener tales especificidades es su generación de novo.

Cuando se comparan enzimas con agentes de unión, se proporciona un paradigma de especificidad por anticuerpos que reconocen epítopos individuales como estructuras pequeñas definidas dentro de moléculas grandes. El vasto intervalo de origen natural de especificidades de anticuerpo se atribuye a la diversidad generada por el sistema inmune en combinación con la selección natural. Varios mecanismos contribuyen al vasto repertorio de especificidad de anticuerpos y aparecen en diferentes etapas de la generación de respuesta inmune y maduración de anticuerpos (Janeway, C y col. (1999) Immunobiology, Elsevier Science Ltd., Garland Publishing, Nueva York) . Específicamente, los anticuerpos contienen regiones determinantes de complementariedad (CDR) que interaccionan con el antígeno de una manera altamente específica y permiten la diferenciación incluso entre epítopos muy similares. La cadena ligera así como la pesada del anticuerpo contribuyen cada una con tres CDR al dominio de unión. En la naturaleza se usa la recombinación de diversos segmentos génicos combinados con mutagénesis adicional en la generación de CDR. Como resultado, las secuencias de los seis bucles de CDR son altamente variables en composición y longitud y esto forma la base de la diversidad de especificidades de unión en los anticuerpos. No se conoce un principio similar para la generación de una diversidad de especificidades catalíticas en la naturaleza.

La catálisis, es decir el aumento de la velocidad de una reacción química específica, es además de la unión la función proteica más importante. Las propiedades catalíticas, es decir enzimas, se clasifican de acuerdo con la reacción química que catalizan.

Las transferasas son enzimas que transfieren un grupo, por ejemplo, el grupo metilo o un grupo glucosilo, de un compuesto (generalmente considerado como donador) a otro compuesto (generalmente considerado como aceptor) . Por ejemplo, las glucosiltransferasas (EC 2.4) transfieren restos glucosilo de una molécula donadora a una aceptora. Algunas de las glucosiltransferasas también catalizan la hidrólisis, que puede considerarse como transferencia de un grupo glucosilo del donador al agua. La subclase se subdivide adicionalmente en hexosiltransferasas (EC 2.4.1) , pentosiltransferasas (EC 2.4.2) y las que transfieren otros grupos glucosilo (EC 2.4.99, Comité de Nomenclatura de la Unión Internacional de Bioquímica y Biología Molecular (NC-IUBMB) ) .

Las oxidorreductasas catalizan óxido-reducciones. El sustrato que se oxida se considera donador de hidrógeno o electrones. Las oxidoreductasas se clasifican como deshidrogenasas, oxidasas, mono- y dioxigenasas. Las deshidrogenasas transfieren hidrógeno de un donador de hidrógeno a una molécula aceptora de hidrógeno. Las oxidasas reaccionan con oxígeno molecular como aceptor de hidrógeno y producen productos oxidados así como peróxido de hidrógeno o agua. Las monooxigenasas transfieren un átomo de oxígeno del oxígeno molecular al sustrato y uno se reduce a agua. Por el contrario, las dioxigenasas catalizan la inserción de ambos átomos de oxígeno del oxígeno molecular al sustrato.

Las liasas catalizan reacciones de eliminación y de este modo generan dobles enlaces o, en la dirección inversa, cataliza las adiciones en dobles enlaces. Las isomerasas catalizan reordenamientos intramoleculares. Las ligasas catalizan la formación de enlaces químicos a costa de consumo de ATP.

Finalmente, las hidrolasas son enzimas que catalizan la hidrólisis de enlaces químicos como C-O o C-N. La clasificación E. C. de estas enzimas generalmente las clasifica según la naturaleza del enlace hidrolizado y según la naturaleza del sustrato. Las hidrolasas tales como lipasas y proteasas desempeñan un papel importante en la naturaleza así como en aplicaciones técnicas de biocatalizadores. Las proteasas hidrolizan un enlace peptídico dentro de un contexto de un oligo- o polipéptido. Dependiendo del mecanismo catalítico las proteasas se agrupan en proteasas aspárticas, serina, cisteína, metalo- y treonina proteasas (Handbook of proteolytic enzymes. (1998) Eds: Barret, A; Rawling, N.; Woessner, J.; Academic Press, Londres) . Esta clasificación se basa en las cadenas laterales de aminoácidos que son responsables de la catálisis y que se presentan normalmente en el sitio activo en orientación muy similar entre sí. El enlace escindible del sustrato se hace coincidir con los restos catalíticos debido a interacciones específicas entre las cadenas laterales de aminoácidos del sustrato y regiones complementarias de la proteasa (Perona, J. & Craik, C (1995) Protein Science, 4, 337-360) . Los restos del extremo N- y C- terminal del enlace escindible se denominan habitualmente P1, P2, P3 etc. y P1', P2', P3' y los bolsillos de unión complementarios al sustrato S1, S2, S3 y S1', S2', S3', respectivamente (nomenclatura de acuerdo con Schlechter & Berger, Biochem. Biophys. Res. Commun. 27 (1967) 157-162) . La selectividad de las proteasas puede variar ampliamente de ser prácticamente no selectivas, por ejemplo, las subtilisinas, pasando por una preferencia estricta en la posición P1, por ejemplo, la Tripsina que corta selectivamente en el extremo C-terminal de restos de arginina o lisina, hasta proteasas altamente específicas, por ejemplo activador de plasminógeno de tipo tisular humano (t-PA) que escinde en el extremo C-terminal de la arginina en la secuencia CPGRWG (Ding, L y col. (1995) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 92, 7627-7631; Coombs, G y col. (1996) J. Biol. Chem. 271, 4461-4467) .

La especificidad de las proteasas, es decir su capacidad para reconocer e hidrolizar preferentemente ciertos sustratos peptídicos, puede expresarse de forma cualitativa y cuantitativa. La especificidad cualitativa se refiere al tipo de restos aminoacídicos que se aceptan por una proteasa en ciertas posiciones del sustrato peptídico. Por ejemplo, la tripsina y t-PA se relacionan con respecto a su especificidad cualitativa, puesto que ambas de ellas requieren en... [Seguir leyendo]

1. Un procedimiento para generar una enzima proteolítica que tenga especificidad definida no conferida por el armazón proteico para al menos un sustrato diana que comprende al menos las siguientes etapas:

(a) proporcionar un armazón proteico que tenga al menos 70 % de homología con tripsina humana I que tenga la secuencia de aminoácidos mostrada en SEC ID Nº: 1, que catalice al menos una reacción química en al menos un sustrato,

(b) generar una biblioteca de enzimas proteolíticas o enzimas proteolíticas aisladas combinando un polinucleótido que codifica el armazón proteico de la etapa (a) mediante inserción o sustitución con 1 a 11 regiones determinantes de especificidad (SDR) , en la que las SDR son secuencias oligonucleotídicas sintéticas completa o parcialmente aleatorias que codifican secuencias peptídicas con una longitud de menos de 50 restos aminoacídicos en una o más posiciones del grupo de posiciones dentro del polinucleótido que codifica el armazón proteico que corresponde estructuralmente o por homología de secuencia de aminoácidos a las regiones 18-25.

3. 48.

5. 63.

7. 86.

12. 130.

14. 156.

16. 171 .

19. 204 en tripsina humana I que tiene la secuencia de aminoácidos mostrada en SEC ID Nº: 1, expresar dichas enzimas y

(c) seleccionar de la biblioteca de enzimas proteolíticas generada en la etapa (b) una o más enzimas que tengan especificidades definidas no conferidas por el armazón proteico proporcionado en la etapa (a) para al menos un sustrato diana.

2. El procedimiento de acuerdo con la reivindicación 1, en el que las secuencias peptídicas insertadas o sustituidas en la etapa (b) son completa o parcialmente aleatorias y/o tienen una variación de longitud; y/o en el que la selección en la etapa (c) se consigue cribando con respecto a la actividad enzimática y/o la afinidad enzimática

(i) en concentraciones de sustrato diana bajas,

(ii) usando el sustrato diana y al menos un sustrato más para comparación,

(iii) añadiendo en exceso otros sustratos distintos del sustrato diana, usando este modo los sustratos diana añadidos como competidores,

(iv) añadiendo inhibidores de enzima,

(v) seleccionando enzimas que se unen preferentemente al sustrato diana y seleccionado de este subgrupo las enzimas que convierten el sustrato o

(vi) cualquier combinación de las mismas.

3. El procedimiento de acuerdo con la reivindicación 1, que comprende al menos las siguientes etapas:

(a) proporcionar un primer fragmento de armazón proteico,

(b) conectar dicho fragmento de armazón proteico mediante un engarce peptídico con una primera región determinante de especificidad, y opcionalmente

(c) conectar el producto de la etapa (b) mediante un engarce peptídico con un péptido de región determinante de especificidad adicional o con un fragmento de armazón proteico adicional, y opcionalmente

(d) repetir la etapa (c) durante tantos ciclos como sea necesario para generar una enzima suficientemente específica y

(e) seleccionar de la población generada en las etapas (a) - (d) una o más enzimas que tengan las especificidades deseadas para el uno o más sustratos que no se confieren por el fragmento de armazón proteico proporcionado de la etapa (a) .