Nueva enzima para la biosíntesis de isoprenoides.

Se ha encontrado una nueva enzima con actividad 1-desoxi-D-xilulosa 5-fosfato reductoisomerasa que cataliza la reacción de producción de 2-C-metil-D-eritritol 4-fosfato a partir de 1-desoxi-D-xilulosa 5-fosfato,

que tiene la secuencia de aminoácidos SEQ ID NO: 41. La enzima es útil en la síntesis de isoprenoides, particularmente en la síntesis de 2-C-metil-D-eritritol 4-fosfato.

Nueva enzima para la biosíntesis de isoprenoides.

La presenteinvención se enmarcade manera general enel campodela biología molecular y la microbiología.En particular, la invención se refiere a enzimas involucradas en la síntesis de isoprenoides en bacterias.

Estado de la técnica

Los isoprenoidesoterpenoides, unodelosgruposmásabundantesde compuestos naturales, tienenpapelesvariados en la respiración, fotosíntesis, estructura de membranas, interacciones aleloquímicas, y regulación del crecimiento, entre otras.Todoslosorganismosde vidalibre sintetizan isoprenoidesa partirdelos precursoresde cinco átomosde carbono isopentenil difosfato (IPP) , y su isómero enel doble enlace dimetilalil difosfato (DMAPP) . Durante décadas secreyóqueelIPPse sintetizabaexclusivamenteapartirdeacetil coenzimaAmediantelarutadelmevalonato (MVA) , yqueluegose convertíaen DMAPP mediante una IPP/DMAPP isomerasa (IDI) .Sin embargo, a principios de los años noventa del siglo pasado se descubrió que tanto el IPP como el DMAPP podían ser sintetizados simultáneamente a partir de piruvatoygliceraldehído3-fosfato mediante una ruta alternativa conocida actualmente como ruta del2-Cmetil-D-eritritol 4-fosfato (MEP) , o también como la ruta no-mevalonato.

En estos momentos está bien establecido que la mayoría de organismos emplean tan sólo uno de las dos rutas de síntesisde isoprenoides.De este modo, arqueas (Archaebacteria) , hongosyanimales sintetizan IPPa partirdeMVA, mientras que la mayoría de las bacterias (Eubacteria) sólo empleanla ruta MEP para la producción de precursores isoprenoides. Las plantas emplean ambas rutas, pero en diferentes compartimentos celulares: la ruta MVAsintetiza precursores isoprenoides citosólicos, mientras que la ruta MEP está localizada en los plástos.

Dado que la ruta MEP está ausente en los animales (incluidos los humanos) pero es esencial en un gran número de importantes patógenos bacterianos, se ha propuesto como una nueva diana prometedora para el desarrollo de nuevos agentes anti-infecciosos. Sin embargo, la información acerca de los posibles mecanismos de resistencia a un bloqueo de la ruta MEP es muy escasa. La resistencia a antibióticos puede ser originada por una exportación activa o un bloqueo en la entrada del fármaco, por su inactivación dentro de la célula, por modificación genética de su diana protéica,

o por el uso de una ruta alternativa no afectada por el inhibidor, por mencionar tan solo algunas posibilidades. El inhibidor mejor caracterizado de la ruta MEP es la fosmidomicina (FSM) , identificada inicialmente como un antibiótico natural eficaz contra un amplio espectrode bacterias.La FSM es un inhibidor específicodela1-desoxi-D-xilulosa5fosfato (DXP) reductoisomerasa (DXR) , la enzima que cataliza la producción de MEP a partir de DXP de un modo dependiente deNADPH, en lo que constituye el primer paso específico de la ruta. La entrada de FSM en las células bacterianasesun procesode transporteactivollevadoacaboporel transportadorde glicerol3-fosfato (GlpT) deun modo dependiente de cAMP. Un gen glpT deficiente en mutantes de Escherichia coli. o la ausencia de un homólogo de GlpT en otras bacterias como Mycobacterium tuberculosis conducea una resistenciaa FSM.La sobreexpresióndel gen fsr de E. coli.que codifica una proteína similar a las proteínas bacterianas de exportación de fármacos, también conduceala resistenciaa FSM, probablemente porque esta proteínafacilitalaexportación del inhibidor. Más aún, se ha visto que varias mutaciones independientes son capaces de rescatar la supervivencia de cepas de E. coli deficientes en los dos primeros enzimas de la ruta MEP, DXP sintasa (DXS) yDXR, lo que sugiere que la bacteria puede responder a un bloqueo de estas actividades mediante el uso de otras enzimas que producen DXP o MEP cuando sufren mutaciones.

Además del estudio de las enzimas de la ruta MEP como dianas para el desarrollo de agentes anti-infecciosos, es igualmente de interés estudiar estas enzimas para mejorar los procedimientos a nivel industrial para la síntesis de isoprenoides.Losisoprenoides, graciasasuampliadiversidad estructural, poseenmuchas aplicacionesenla industria, como por ejemplo, como fármacos, diluyentes, aromatizantes, biocombustibles, o insecticidas naturales. Algunos isoprenoides utilizadosenla industria sonlos aceites esenciales, los carotenoides, los tocoferoles, el taxol, yla artemisina. Unaalternativamuy prometedoraparasu producción industrialesla ingeniería metabólicade bacteriasyplantaspara ser utilizadas como biofactorías de isoprenoides de interés.

Hay un conocimiento muy limitado de las enzimas involucradas en la síntesis de isoprenoides en las diferentes es-pecies (bacterias, plantas, etc) .Porlotanto, esdeseableampliaresteconocimientoyproporcionarnuevas herramientas paraavanzar enla síntesisyla aplicación industrialde estos compuestos.

Explicación de la invención

Los inventores han encontrado sorprendentemente una nueva clase de enzimas oxidoreductasas que cataliza la conversión de DXP a MEP para la síntesis de isoprenoides a través de la ruta MEP en células procariotas.

Los inventores han detectado que los genomas completamente secuenciados de un número de bacterias, incluida la patógena Brucella abortus 2308. contienen los genes de la vía MEP con la única excepción de la que codifica para DXR. La presente invención se refiere pues a la clonación del gen que codifica la enzima que es utilizada en estos organismos para producir MEP, la demostración de su actividad bioquímica tanto in vivo como in vitro.y la determinación de su distribución filogenética.

En esta descripción se utilizará DRL para denominar a la nueva clase de enzima identificada. DRL proviene de DXR-Like.

La secuencia de aminoácidos de la proteína DRL de B. abortus 2308 clonada coincide con la secuencia descrita en el NCBI con referencia Swiss-Prot Q2YIM3, que corresponde a la secuencia de aminoácidos predicha a partir de la secuencia de nucleótidos BAB2 0264con GeneID 3827542. En la referencia Q2YIM3 se describe esta secuencia como “oxidoreductasa putativa”. Es decir, la definición de la posible función de la secuencia de aminoácidos se realizó automáticamenteapartirde una predicciónde función comparando secuenciasde basesde datos.Dela misma manera, en la referencia BAB2 0264se describen como funciones putativas “homoserina deshidrogenasa predicha”y“proteína de uniónaNAD (P) (+) con undominio Rossmann-fold”.

Lo anterior implica que la secuencia de nucleótidosyaminoácidos como tal está descrita, pero la actividad propuesta para la proteína es el resultado de una predicción; es decir, no seha clonado físicamentey se desconoce su auténtica función biológica.

Contrariamente, losinventoreshan clonadola secuenciade nucleótidosyhan encontradoquela proteína codificada (DRL) es una proteína funcional. Los inventores han encontrado que DRL es una enzima con actividad1-desoxiDxiluloxa5-fosfato reductoisomerasa que catalizala reacciónde producciónde MEPa partirde DXPde forma similar a la descrita para el enzima DXR.

La fosmidomicina, un inhibidor competitivo específico de DXR, inhibió el crecimientode células de B. abortus queexpresabanel transportadorGlpTde E. coli (requeridoparala entradade fosmidomicina) , confirmandoqueexiste en estas bacterias una actividad similaraDXR in vivo (DRL) .Se encontróquela proteínaDRLde B. abortus pertenece a unafamiliade proteínasno caracterizadasy similaresen secuenciaala homoserinadeshidrogenasa. Experimentos posteriores confirmaron queDRLyDXR catalizanla misma reacción bioquímica in vitro.

La enzima activa DRL de B. abortus se caracteriza por ser un homodímero con un peso molecular determinado por cromatografía de exclusión molecular de 80 kDa (aproximadamente el doble que el tamaño deducido de la secuencia proteica) . DRL presenta una actividad máxima en unpH entre 7.5y8, y una temperatura óptima entre40y45ºC.La curva de parámetros enzimáticos de Lineweaver-Burk indica una Vmax = 0.083 µmolNADPH min−1 mg−1, una kcat =

0.065 s−1, y una Km (DXP) = 109 µMpara la enzima recombinante DRL.

Se realizóun análisis filogenéticoyfuncional entre diferentes especiesde bacteriasyse detectóqueotras bacterias además de B. abortus poseen proteínas homologas a DRL, que también complementan funcionalmente a la cepa EcAB4-10 de E. coli deficiente en DXR. Estas enzimas se agrupan dentro del mismo... [Seguir leyendo]

1. Enzima con actividad1-desoxi-D-xilulosa5-fosfato reductoisomerasa que cataliza la reacción de producción de2-C-metil-D-eritritol4-fosfato (MEP) a partirde1-desoxi-D-xilulosa5-fosfato (DXP) , que tienela secuenciade aminoácidos SEQ ID NO: 41.

2. Enzima según la reivindicación 1, que es de Brucella abortus.

3. Enzima según la reivindicación 2, que es de Brucella abortus 2308.

4.Vectordeexpresión que permitelaexpresión en bacterias de la enzima definida en cualquierade las reivindicaciones 1-3 activa, que comprende la secuencia de nucleótidos SEQ ID NO: 51.

5. Usode una enzima según sedefine en cualquierade las reivindicaciones 1-3, paralasíntesisde isoprenoides.

6. Uso según la reivindicación 5, para la síntesis de MEP.

7. Método de obtención de MEP que comprende:

(a) expresarla enzima activa definida en cualquierade las reivindicaciones 1-3 en unsistema celular;y

(b) cultivarel sistema celulardelpaso (a) bajo condicionesy enun medioque permitenla producciónyacumulación de MEP.

8. Método de obtención de MEP que comprende:

(a) proporcionar un sistema celular que permitalaexpresióndela enzima definida en cualquierade las reivindicaciones 1-3;

(b) cultivarel sistema celulardelpaso (a) bajo condicionesque permitenla produccióndela enzima;y

(c) cultivarel sistema celular bajo condicionesy en un medio que permitenla producciónyacumulaciónde MEP

o bien purificarel enzimayutilizarlo en un sistema in vitro bajo condicionesyenun medioque permitenla obtención deMEP, dondeelmediocomprendeun sustrato seleccionadodelgrupoqueconsisteenDXPyunamezcladepiruvato ygliceraldehído 3-fosfato.