NANOLIPOSOMAS FUNCIONALIZADOS CON PÉPTIDOS.

NANOLlPOSOMAS FUNCIONALlZADOS CON PÉPTIDOS La presente invención se encuentra dentro del campo de la medicina, de la 5 química, la bioquímica y la inmunología, y se refiere al uso de nanoliposomas funcional izados con péptidos en su superficie que permiten la identificación de tejidos y/o células diana y la liberación de fármacos de forma selectiva, y en particular, a la funcionalización de nanoliposomas con el péptido VIP. La presente invención también se refiere a las composiciones, al procedimiento de 10 preparación ya los usos de dichos nanoliposomas. ESTADO DE LA TÉCNICA ANTERIOR Existe un creciente interés por los efectos biológicos de las nanopartículas, de 15 su toxicidad y su alcance en función del medio (M. Tsoli et al. 2005. Small (2005) ; 1 :841) , por ejemplo, su uso potencial como herramienta terapéutica en tratamientos de cáncer (EI-Sayed et al., 2005. Nano Letters Vo1.5, 5. 829-834) . Gracias al enorme interés de esos nano-bioconjugados se han desarrollado un 20 amplio rango de aplicaciones tales como distribución de fármacos, marcadores moleculares, análisis bioquímicos ultrasensibles, desarrollo de dispositivos "Iab-on-a-chip", construcción de nanocomponentes electrónicos, motores nano-moleculares ... etc [C. M. Niemeyer, C. A. Mirkin Eds. Nanobiotechnology, Wiley-VCH 2004] 25 Entre los diferentes tipos de nanopartículas, los nanoliposomas son de especial relevancia debido a que son los sistemas nanométricos mejor establecidos clínicamente para el transporte y envío de fármacos gracias a que no son citotóxicos, son biocompatibles y biodegradables, y además su síntesis es 30 relativamente barata y de fácil escalado en procesos industriales. Los liposomas en general se han utilizado en terapias para el tratamiento de cáncer durante más de una década ya que han demostrado reducir de forma sistémica los efectos secundarios, la toxicidad y facilitando la eliminación del fármaco. ( Torchlin, 2005. Nat Rev. Drug Discover y 4, 145) . Los nanoliposomas se pueden utilizar como transportadores de diversas 5 sustancias tanto en su exterior como en su interior y para una variedad de aplicaciones biomédicas como terapia génica o para el envío de fármacos, de forma que los ácidos nucleicos o el fármaco vayan protegidos en su interior evitando su degradación enzimática y su contacto directo con otras células sanas. Por otra parte permiten el envío de moléculas biológicamente activas de 10 carácter lipófilo y tamaños superiores a los 500 Da, dos de los problemas más importantes que puede presentar una molécula activa para terminar como principio activo de un medicamento. Los nanoliposomas de diversos tamaños, normalmente menores de 400 nm 15 pueden entrar en las zonas en las que existen tumores de forma rápida ya que la pared del endotelio vascular se encuentra fenestrada. Por el contrario, los nanoliposomas permanecen en el torrente sanguíneo del tejido sano mediante la pared del endotelio vascular no fenestrado. 20 Además, la funcionalización de los nanoliposomas con péptidos que reconocieran con mayor selectividad las dianas terapéuticas, permitiendo el direccionamiento de forma específica en aquellos caso en los que se conoce que dichas dianas sobreexpresan los receptores que reconocen dichos pépidos. 25 Actualmente existen liposomas funcionalizados con péptidos en su superficie. Por ejemplo, los liposomas funcionalizados con tuftsina han permitido aumentar la eficacia de estibogluconato sódico (Agrawal & Gupta, 2000. Adv. Drug Deliv. Rev. 41: 135-146;, Gupta & Haq, 2005. Methods Enzymol. 391: 291-304) Y 30 anfotericina B (Gupta & Haq, 2005. Methods Enzymol. 391: 291-304, Agrawal et al., 2002. J. Drug Target. 10: 41-45) . Sin embargo, aún no se conocen nanoliposomas funcional izados con neropéptidos, y una de las limitaciones para el uso clínico de los neuropéptidos en general, y del VIP en particular, ha sido siempre su corta vida media en circulación. Esto implica la necesidad de administrar crónicamente dicho péptido, aumentando los costes económicos y dificultando su posología en pacientes. Además, el proceso de funcionalización de nanoliposomas con VIP se enfrenta al problema añadido de diseñar un 5 procedimiento en el que quede el extremo carboxilo terminal de VIP libre, ya que es por este extremo por el que interacciona con sus receptores específicos de membrana. Es necesario, por tanto, desarrollar un procedimiento de funcionalización de nanoliposomas con péptidos, dejando el extremo carboxilo terminal de dicho péptido libre para interaccionar con su receptor. 10 DESCRIPCiÓN DE LA INVENCiÓN Los autores de la presente invención han desarrollado nanoliposomas 15 funcionalizados con péptidos en su superficie, estables, no tóxicos, solubles en agua, y compatibles con los sistemas biológicos, y un procedimiento para su obtención, que son útiles para vehiculizar principios activos y/o composiciones farmacéuticas. Además, han demostrado que la funcionalización de VIP en la superficie del nanoliposoma, optimizando su síntesis a un tamaño de 100 nm 20 se maximiza su entrada en las zonas con tumores debido al endotelio vascular fenestrado, y a la vez se permite su direccionamiento de forma específica en aquellos caso en los que se conoce que las células cancerosas sobreexpresan los receptores de la familia de VIP del tipo siete dominios transmembrana acoplados a proteínas G, como es el caso del cáncer de próstata. Además de 25 permitir que VIP actúe como agente terapéutico sobre células diana o como modo de liberación de fármacos sobre células que sobreexpresan receptores VIP, aumenta la vida media de la molécula unida a la misma, ya que dificulta el ataque proteolítico. 30 Por tanto, un primer aspecto de la invención se refiere a un nanoliposoma funcionalizado con un péptido en su superficie, de ahora en adelante, nanoliposoma de la invención. En una realización preferida, el extremo carboxilo-terminal del péptido queda libre, pudiendo interaccionar con su receptor mediante su extremo carboxilo-terminal. En otra realización preferida, el péptido se selecciona de la lista que comprende: glucagon, GIP (gastric inhibitor y polypeptide) , secretina, hormona de crecimiento, somatoliberina, somatotropina, péptido PHI (peptide histidine isoleucine) , péptido PHM (Peptide 5 Histidine-Methionine) , PACAP (pituitar y adenylate cyclase-activating peptides) , adrenomedulina, corticostatina y VIP (vasoactive intestinal peptide) . Una de las limitaciones para el uso clínico de los péptidos en general, fundamentalmente de los neuropéptidos, y del VIP en particular, es su corta 10 vida media en circulación, lo que haría necesaria la administración crónica del mismo, aumentando los costes económicos y dificultando su posología al paciente. La unión de los péptidos a los nanoliposomas, yen concreto de VIP, aumenta la vida media de las moléculas unidas a los mismos, ya que dificulta el ataque proteolítico. 15 Por tanto, en otra realización preferida de este aspecto de la invención, el péptido es un neuropéptido, y más preferiblemente, es el péptido intestinal vasoactivo (VIP) . 20 Tal como se entiende en esa memoria, un neuropéptido se refiere a pequeñas moléculas parecidas a proteínas de un enlace peptídico de dos o más aminoácidos y que se diferencian de proteínas por su longitud, y porque se originan por transducción sináptica cerebral. Su dimensión puede variar desde dos aminoácidos, como la carnosina, hasta más de 40 como la CRH 25 (Corticotropin-releasing hormone u hormona liberadora de corticotropina) . Tienen función cerebral tanto estimulante como inhibidora, produciendo efectos como la analgesia, apetito, sueño, etcétera. En esta memoria se entiende como péptido intestinal vasoactivo (VIP por sus 30 siglas en inglés vasoactive intestinal peptide) , es una hormona polipeptídica formada por 28 residuos de aminoácidos y es producida por muchas estructuras del cuerpo humano como el aparato digestivo, el páncreas y el núcleo supraquiasmático del hipotálamo en el cerebro. Se caracteriza por su propiedad vasodilatadora y su actividad en el sistema nervioso periférico (por ejemplo, el VIP relaja los pulmones, la traquea y la musculatura gástrica) . Inhibe la secreción de enzimas gástricas y estimula la secreción de glucagón, insulina y somatostatina, aumenta la adenilciclasa, así como la secreción biliar 5 en el hígado. 10 El VIP, o "vasoactive intestinal peptide", también denominada como PHM27 ó MGC13587. Está codificado por un gen que se encuentra en el cromosoma 6 (6q25) . Su secuencia aminoacídica se encuentra en la SEO ID NO: 1. En el contexto de la presente invención, VIP se define también por una secuencia de nucleótidos o polinucleótido, que constituye la secuencia codificante de la proteína recogida en la SEO ID NO: 1, Y que comprendería... [Seguir leyendo]

1-Un nanoliposoma funcionalizado con un péptido en su superficie.52-El nanoliposomasegún la reivindicación anterior, donde elextremo carboxilo-terminal delpéptidoqueda libre.3-El nanoliposomasegúncualquiera de las reivindicaciones 1-2, dondeel péptido es el péptido VIP.104-El nanoliposomasegúncualquiera de las reivindicaciones 1-3que comprende:1, 2-distearoil-sn-glicero-3-fosfocolina (DSPC) , 1, 2-dipalmitoil-sn-glicero-3-fosfocolina (DPPC) y al menos un fosfolípido pegilado.155-El nanoliposomasegún la reivindicación anterior, donde el fosfolípido pegilado es:a.1, 2-distearoil-sn-glicero-3-fosfoetanolamina-N-[amino (polietilen 20glicol-Maleimida (DSPE-PEG-Maleimide) , b.1, 2-distearoil-sn-glicero-3-fosfoetanolamina-N-[amino (polietilenglicol (DSPE-PEG) , o una combinación de ambos.256-El nanoliposomasegúncualquiera de las reivindicaciones 1-5, obtenible mediante un procedimiento que comprende:a.formar un film de lípidos mediante evaporación de fase reversa de un compuesto que comprende 1, 2-distearoil-sn-glicero-3-fosfocolina (DSPC) , 1, 2-dipalmitoil-sn-glicero-3-fosfocolina30 (DPPC) y al menos un fosfolípido pegilado (DPPC) y al menos un fosfolípido pegilado, b.añadirel solvente orgánico y la fase acuosa quedando finalmente un ratio de volumen de aproximadamente 4:1 (fase orgánica:faseacuosa) , c.someter el sistema de dos fases a sonicación hasta que la muestra aparece dispersa en una sola fase, 5d.evaporar todo el solvente orgánico mediante unrotavapor hasta obtener una fase de gel, e.convertirel gel en una suspensión acuosa, donde se han formado los liposomasf.convertir los liposomas de (e) en nanoliposomas mediante 10sonicación, hasta un tamaño medio de 500 nm, preferiblemente de un tamaño medio de 400 nm o menor, y más preferiblemente de un tamaño medio menor de 200 nm, g.purifica los nanoliposomasmediante una columna de Sephadex, preferiblemeneG-50, 15a.añadir añadir al menos 100 μg del péptido, preferiblemente en una cantidad aproximada de 150 μg, a losnanoliposomas del paso (f) y mantener en agitación y temperatura ambiente al menos 10 horas, y preferiblemente entre 12 y 16 horas, yh.purificar la mezcla resultante del paso (h) mediante diálisis frente 20a agua desionizada durante al menos 15 horas, preferiblemente durante al menos 20 horas, 22 horas, y mucho más preferiblemente, durante24 horas.7-El nanoliposomasegúncualquiera de las reivindicaciones 1-6, donde el 25DPPC y el DSPC se encuentranen una relación de masa de aproximadamente 6:4.8-El nanoliposomasegúncualquiera de las reivindicaciones 1-6, donde el DSPE-PEG y el DSPE-PEG-Maleimide se encuentran a una 30concentración final del 5 y 10%, respectivamente. 9-El nanoliposomasegúncualquiera de las reivindicaciones 6-8, donde el solvente orgánico que consiste en una mezcla de di-etil-éter y cloroformo aaproximadamnte el 50%.10-El nanoliposomasegúncualquiera de las reivindicaciones 6-9, donde el5ratio envolumen fase orgánica: fase acuosa es deaproximadamente 4:1.11-El nanoliposomasegúncualquiera de las reivindicaciones 6-10, donde el sonicado del paso (c) se hace en un baño sonicadorhasta que la 10muestra aparece dispersa en una sola fase.12-El nanoliposomasegúncualquiera de las reivindicaciones 6-11, donde la evaporación de todo el solvente orgánico mediante el rotavapor del paso 15 (d) hasta alcanzar una fase de gel, se realiza a una temperatura de 40ºC y a una rotación de 120 r.p.m..13-El nanoliposomasegúncualquiera de las reivindicaciones 6-12, donde sonicación de la muestra del paso (f) se realiza en un baño sonicador a 20más de 60ºC.14-El nanoliposomasegúncualquiera de las reivindicaciones 1-3, donde el tamaño medio esde entre 75 y 125 nm, preferiblemente de entre 85 y115 nm, y más preferiblemente de aproximadament.

9. 105nm.2515-Uso deunnanoliposomacomo se define en cualquiera de las reivindicaciones 1-14, para la vehiculización de principios activos.3016-Uso del nanoliposomasegúnla reivindicación anterior, donde elprincipio activo tiene actividad antitumoral. 17-Uso del nanoliposomasegúnla reivindicación15, donde el principio activo tiene actividad antiinflamatoria.18-Uso deunnanoliposomacomo se define en cualquiera de las 5reivindicaciones 1-14, para la vehiculización de composiciones farmacéuticas.19-Uso deunnanoliposomacomo se define en cualquiera de las reivindicaciones 1-14, en la elaboración de un medicamento para el 10tratamiento de enfermedades que cursan con proliferación celular.20-Uso del nanoliposomasegúnla reivindicación anterior, donde la enfermedad que cursa con proliferación celular se selecciona de la lista que comprende: neoplasmas epiteliales malignos, cáncer de pulmón y 15ºtros cánceres como cáncerde estómago, colon, mama, próstata, hígado y vejiga urinaria.21-Uso del nanoliposomasegúncualquiera de las reivindicaciones 19-20, donde la enfermedad que cursa con proliferación celulares cáncer de 20próstata.22-Un procedimiento de obtención de nanoliposomas funcionalizado con péptidos, que comprende las etapas de:25a.formar un film de lípidos mediante evaporación de fase reversa de un compuesto que comprende , 1, 2-distearoil-sn-glicero-3-fosfocolina (DSPC) , 1, 2-dipalmitoil-sn-glicero-3-fosfocolina (DPPC) y al menos un fosfolípido pegilado, b.añadirel solvente orgánico y la fase acuosa quedando finalmente 30un ratio de volumen de aproximadamente4:1 (fase orgánica:faseacuosa) , c.someter el sistema de dos fases a sonicación hasta que la muestra aparece dispersa en una sola fase, d.evaporartodo el solvente orgánico mediante unrotavapor hasta obtener una fase de gel, e.convertirel gel en una suspensión acuosa, donde se han formado 5los liposomasf.convertir los liposomas de (e) en nanoliposomas mediante sonicación, hasta un tamaño medio menor de 500 nm, preferiblementede un tamaño medio de 400 nm o menor, y más preferiblemente de un tamaño medio menor de 200 nm, 10g.purifica los nanoliposomasmediante una columna de Sephadex, preferiblemente G-50, h.añadir el péptido a losnanoliposomas del paso (g) y mantener en agitación y temperatura ambiente de al menos 10horas, y preferiblemente entre 12 y 16 horas, y15i.purificar la mezcla resultante del paso (h) mediante diálisis frente a agua desionizada durante al menos 15 horas, preferiblemente durante al menos 20 horas, 22 horas, y mucho más preferiblemente, duranteal menos 24 horas.2023-El procedimientosegúnla reivindicación 22, donde el DPPC y el DSPC se encuentranen una relación de masa de aproximadamente 6:4.24-El procedimientosegúncualquiera de las reivindicacione.

2. 23, donde el DSPE-PEG y el DSPE-PEG-Maleimide se encuentran a una 25concentración final del 5 y 10%, respectivamente.25-El procedimientosegúncualquiera de las reivindicacione.

2. 24, donde el solvente orgánico que consiste en una mezcla de di-etil-éter y cloroformoaaproximadamnte el 50%.30 26-El procedimientosegúncualquiera de las reivindicacione.

2. 25, donde elratio envolumen fase orgánica: fase acuosa es deaproximadamente 4:1.27-El procedimientosegúncualquiera de las reivindicacione.

2. 26, donde 5el sonicadodel paso (c) se hace en un baño sonicadorhasta que la muestra aparece dispersa en una sola fase.28-El procedimientosegúncualquiera de las reivindicacione.

2. 27, donde 10la evaporación de todo el solvente orgánico mediante el rotavapor del paso (d) hastaalcanzar una fase de gel, se realiza a una temperatura de 40ºC y a una rotación de 120 r.p.m..29-El procedimientosegúncualquiera de las reivindicacione.

2. 28, donde 15sonicación de la muestra del paso (f) se realiza en un baño sonicador a más de 60ºC.30-El procedimientosegúncualquiera de las reivindicacione.

2. 29, donde el tamaño medio esde entre 75 y 125 nm, preferiblemente de entre 85 y 20115 nm, y más preferiblemente de aproximadament.

9. 105 nm.