PROCEDIMIENTO DE DIAGNÓSTICO DEL SÍNDROME DE APNEA-HIPOPNEA OBSTRUCTIVA DEL SUEÑO (SAHS) MEDIANTE LA CUANTIFICACIÓN DE LA EXPRESIÓN DE PHD2 Y/O PHD3.
Procedimiento de diagnóstico del síndrome de apnea-hipopnea obstructiva del sueño (SAHS) mediante la cuantificación de la expresión de PHD2 y/o PHD3.
La presente invención se refiere a un procedimiento para el diagnóstico y la monitorización de respuesta al tratamiento del síndrome de apnea-hipopnea obstructiva del sueño (SAHS) en humanos mediante la determinación cuantitativa de la expresión del gen prolilhidroxilasa 3 (PHD3 = EGLN3 = HPH2), caracterizado porque la determinación se realiza en leucocitos de sangre periférica. Un gen alternativo para el mismo fin es el gen de la prolilhidroxilasa 2 (PHD2 = EGLN1 = HPHP1). En concreto, los genes PHD3 y PHD2 codifican dos prolilhidroxilasas implicadas en la degradación de los factores de transcripción inducible por hipoxia HIF (del inglés, Hypoxia-Inducible Factor)
Tipo: Patente de Invención. Resumen de patente/invención. Número de Solicitud: P200802597.
Solicitante: FUNDACION PROGRESO Y SALUD.
Nacionalidad solicitante: España.
Provincia: SEVILLA.
Inventor/es: NAVARRO ANTOLIN,FRANCISCO J, RIVERO VALDENEBRO,VERONICA, LEON GOMEZ,ELVIRA MARIA.
Fecha de Solicitud: 11 de Septiembre de 2008.
Fecha de Publicación: .
Fecha de Concesión: 20 de Enero de 2012.
Clasificación PCT:
- A61B5/00 NECESIDADES CORRIENTES DE LA VIDA. › A61 CIENCIAS MEDICAS O VETERINARIAS; HIGIENE. › A61B DIAGNOSTICO; CIRUGIA; IDENTIFICACION (análisis de material biológico G01N, p.ej. G01N 33/48). › Medidas encaminadas a establecer un diagnóstico (diagnóstico por medio de radiaciones A61B 6/00; diagnóstico por ondas ultrasónicas, sónicas o infrasónicas A61B 8/00 ); Identificación de individuos.
- G01N33/53 FISICA. › G01 METROLOGIA; ENSAYOS. › G01N INVESTIGACION O ANALISIS DE MATERIALES POR DETERMINACION DE SUS PROPIEDADES QUIMICAS O FISICAS (procedimientos de medida, de investigación o de análisis diferentes de los ensayos inmunológicos, en los que intervienen enzimas o microorganismos C12M, C12Q). › G01N 33/00 Investigación o análisis de materiales por métodos específicos no cubiertos por los grupos G01N 1/00 - G01N 31/00. › Ensayos inmunológicos; Ensayos en los que interviene la formación de uniones bioespecíficas; Materiales a este efecto.
PDF original: ES-2353508_A1.pdf
Fragmento de la descripción:
Procedimiento de diagnóstico del síndrome de apnea-hipopnea obstructiva del sueño (SAHS) mediante la cuantificación de la expresión de PHD2 y/o PHD3.
La presente invención se refiere a un procedimiento para el diagnóstico y la monitorización de respuesta al tratamiento del síndrome de apnea-hipopnea obstructiva del sueño (SAHS) en humanos mediante la determinación cuantitativa de la expresión del gen prolilhidroxilasa 3 (PHD3 = EGLN3 = HPH2), caracterizado porque la determinación se realiza en leucocitos de sangre periférica. Un gen alternativo para el mismo fin es el gen de la prolilhidroxilasa 2 (PHD2 = EGLN1 = HPHP1). En concreto, los genes PHD3 y PHD2 codifican dos prolilhidroxilasas implicadas en la degradación de los factores de transcripción inducibles por hipoxia HIF (del inglés: Hypoxia-Inducible Factor).
Estado de la técnica anterior
El síndrome de apnea-hipopnea obstructiva del sueño (SAHS), o hipoxia intermitente nocturna, es un desorden caracterizado por una interrupción parcial o completa del flujo de aire durante el sueño debido a un colapso de la vía respiratoria superior. Ello conlleva una disminución de la cantidad de oxígeno de la sangre (hipoxemia) y que afecta a un 2-6% de la población adulta (dependiendo de la definición exacta).
Numerosos estudios han puesto en evidencia una relación entre el SAHS no tratado y el deterioro de la calidad de vida, la aparición de hipertensión arterial sistémica, enfermedades cardiovasculares y cerebrovasculares, accidentes de tráfico, así como un exceso de mortalidad asociado al SAHS. Por ello, se considera que el SAHS constituye un problema de salud pública. Por otra parte, el tratamiento con presión positiva continua de la vía aérea (CPAP) es el tratamiento más eficaz y coste-efectivo.
El organismo ha desarrollado todo un sistema de respuestas moleculares, celulares y fisiológicas para contrarrestar los efectos perjudiciales que desencadena una bajada de tensión de oxígeno (hipoxia) en el mismo. Entre estas respuestas se producen unos cambios de expresión génica mediados, al menos en parte, por la activación de una familia de factores de transcripción denominados factores inducibles por hipoxia (HIF). El complejo heterodimérico que forma HIF está controlado por la disponibilidad de oxígeno. Bajo condiciones normóxicas, las proteínas HIFα son hidroxiladas por una familia de prolilhidroxilasas llamadas EGL-Nine homologos (EGLN) lo que provoca su degradación en el proteosoma. Por el contrarío, en situación de hipoxia, debido a que estas enzimas requieren oxígeno molecular para su reacción catalítica, las hidroxilaciones no ocurren de forma eficiente por lo que HIF no se degrada y activa la transcripción de sus genes diana. Los niveles del ARN mensajero (o tránscritos) de dos de los tres tipos de EGLN descritos hasta la fecha son inducibles por hipoxia (PHD3 y PHD2) y presentan en las secuencias de sus promotores génicos elementos de respuesta a hipoxia (sitios de unión para HIF). (PHD3: Pescador N. et al., 2005. Biochem. J. 390:189-197; PHD2: Metzen M. et al., 2005. Biochem. J. 387:711-717).
Un aumento del nivel de expresión de los transcritos de PHD3 y PHD2 en leucocitos humanos clónicos expuestos a hipoxia ha sido demostrado previamente (Del Peso L. et al., 2003. J. Biol. Chem. 278: 48690-48695). No obstante se trataba de experimentos ex vivo y en una línea de células clónicas (Jurkat) mantenida artificialmente en laboratorios. No existen evidencias del mismo fenómeno en leucocitos de sangre periférica (PBL) humanos expuestos a hipoxia ex vivo (es decir, extraídos del torrente circulatorio por venopunción y seguidamente expuestos en un incubador a hipoxia) ni, lo que es más importante, en PBL expuestos a hipoxia in vivo en el mismo torrente circulatorio en alguna patología con hipoxemia (como son los PBL directamente obtenidos de pacientes con SAHS, es decir, leucocitos expuestos in vivo a hipoxemia).
En la actualidad para hacer un estudio de las posibles modificaciones del nivel de expresión de genes de interés en hipoxia se requiere realizar una biopsia, que es un procedimiento mucho más cruento que una simple venopunción.
Descripción de la invención
La invención se enfrenta, en general, con el problema de encontrar un método de diagnóstico cuantitativo para la determinación y/o detección del grado de exposición a hipoxemia de los pacientes con síndrome de apnea-hipopnea obstructiva del sueño (SAHS), graduar el potencial de este tipo de hipoxia sobre el control de la expresión génica en humanos, y monitorizar la respuesta al tratamiento con CPAP; y se hace en células cuyo proceso de extracción no sea agresivo para el paciente.
La solución proporcionada por esta invención se basa en que los autores de la presente invención han descubierto que la expresión de los genes PHD3 (y PHD2) o de sus productos de transcripción o expresión (ARN o proteína) son inducibles por la hipoxia en leucocitos de sangre periférica (PBL), con lo que el nivel de expresión de estos genes permite cuantificar el grado de exposición a la hipoxemia, y así evaluar la severidad del SAHS en función se su capacidad de producir modificación del nivel de expresión de genes inducibles por hipoxia en el ser humano.
Por lo tanto, en un primer aspecto de la presente invención, se proporciona un procedimiento para el diagnóstico del Síndrome de Apnea-Hipopnea obstructiva del Sueño (SAHS) mediante la detección cuantitativa que comprende los siguientes pasos:
Por "leucocitos en sangre periférica" tal y como se utiliza en esta invención debe entenderse, en general, los glóbulos blancos que circulan en la sangre. Hay cinco tipos de leucocitos; neutrófilos, eosinófilos, basófilos, linfocitos y monocitos, que en su mayor parte son del tipo de los neutrófilos y linfocitos. Los leucocitos provienen de una muestra de sangre total obtenida mediante cualquier método tradicional, incluido en el conocimiento general común.
El método proporcionado por esta invención, comprende la detección cuantitativa de los niveles de expresión de gen PHD3 y/o PHD2, donde estos genes codifican proteínas para las enzimas prolil-hidroxilasas de la familia de factores de transcripción inducidos por hipoxia HIF.
Los términos "PHD3" y "PHD2" (también llamados "EGLN3" y "EGLN1" o "HPH2" y "HPH1" respectivamente) son dos genes que codifican proteínas con actividad enzimática del tipo prolil-hidroxilasa, actividad clave en la detección del nivel de oxígeno presente en las células.
Otro aspecto de la presente invención provee un procedimiento para la monitorización de la respuesta al tratamiento del Síndrome de Apnea-Hipopnea obstructiva del Sueño (SAHS) que comprende:
El procedimiento de monitorización de la respuesta al tratamiento del síndrome SAHS comprende una serie de pasos que comienzan por la toma de muestras seriales de sangre por venopunción y extracción del ARNm de los leucocitos de la sangre periférica. Se entiende por toma de muestras seriales a la extracción de sangre de pacientes que han sido sometidos a un tratamiento para mitigar los efectos del síndrome. La toma de muestras... [Seguir leyendo]
Reivindicaciones:
1. Procedimiento para el diagnóstico del Síndrome de Apnea-Hipopnea obstructiva del Sueño (SAHS) que comprende:
2. Procedimiento para la monitorización de la respuesta al tratamiento del Síndrome de Apnea-Hipopnea obstructiva del Sueño (SAHS) que comprende:
3. Procedimiento según la reivindicación 2 donde el tratamiento es una terapia de presión continua positiva de la vía aérea (CPAP).
4. Procedimiento según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, donde la cuantificación de la expresión de los genes PHD2 y/o PHD3 se realiza determinando el nivel de ARNm correspondiente al transcrito de dichos genes.
5. Procedimiento según la reivindicación 4, donde la determinación del nivel de ARNm de PHD2 y/o ARNm de PHD3 se realiza mediante Northern blot, mapeo con la nucleasa S1, reacción en cadena de la polimerasa (PCR), retrotranscripción en combinación con la reacción en cadena de la polimerasa (RT-PCR), retrotranscripción en combinación con la reacción en cadena de la ligasa (RT-LCR), hibridación o microarrays o cualquier otra técnica analítica que permita su detección y/o cuantificación.
6. Procedimiento según las reivindicaciones 4 y 5, donde la determinación del ARNm de PHD2 y/o del ARNm de PHD3 se realiza mediante RT-PCR cuantitativa.
7. Procedimiento según la reivindicación 6, donde se usan los cebadores SEQ ID NO: 1 y SEQ ID NO: 2 para cuantificar el nivel de expresión del gen PHD3.
8. Procedimiento según la reivindicación 6, donde se usan los cebadores SEQ ID NO: 3 y SEQ ID NO: 4 para cuantificar el nivel de expresión del gen PHD2.
9. Procedimiento según la reivindicación 6, donde el gen "housekeeping" es el ADN ribosomal de la subunidad 28S y los cebadores son SEQ ID NO: 5 y SEQ ID NO: 6.
10. Procedimiento según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, donde la cuantificación de la expresión de los genes PHD2 y/o PHD3 se realiza determinando el nivel de expresión de las proteínas correspondientes a dichos genes.
11. Procedimiento según la reivindicación 10, donde la determinación del nivel de expresión de las proteínas se realiza mediante el empleo de anticuerpos, citometría de flujo proteómica o cualquier otra técnica analítica que permita su detección y/o cuantificación.
12. Kit de diagnóstico del Síndrome de Apnea-Hipopnea obstructiva del Sueño (SAHS), caracterizado porque comprende:
13. Kit según la reivindicación 12 (a) donde los reactivos contienen los cebadores del gen PHD3, SEQ ID NO: 1 y SEQ ID NO: 2.
14. Kit según la reivindicación 12 (a) donde los reactivos contienen los cebadores del gen PHD2, SEQ ID NO: 3 y SEQ ID NO: 4.
15. Kit según la reivindicación 12 (a) donde el gen "housekeeping" es el ADN ribosomal de la subunidad 28S y los reactivos contienen los cebadores SEQ ID NO: 5 y SEQ ID NO: 6.
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