Mutantes que tienen capacidad de producir 1,4-butanodiol y procedimiento para la preparación de 1,4-butanodiol utilizando los mismos.

Mutante que muestra elevada producción de 1,4-butanodiol, que es preparado introduciendo o amplificando genesque codifican enzimas que convierten succinato en 4-hidroxibutirato y 4-hidroxibutirato en 1,

4-butanodiol, en unmicroorganismo capaz de producir succinato,

en el que el microorganismo capaz de producir succinato es una bacteria,

el gen que codifica la enzima que convierte succinato en 4-hidroxibutirato es seleccionado del grupo que consiste engenes que codifican succinil-CoA transferasa, semialdehído de succinato dehidrogenasa, 4-hidroxibutiratodehidrogenasa y 4-hidroxibutirato dehidrogenasa, y

el gen que codifica la enzima que convierte 4-hidroxibutirato en 1,4-butanodiol es i) un gen que codifica 4-hidroxibutirato-CoA transferasa y un gen que codifica alcohol dehidrogenasa que reduce 4-hidroxibutirato-CoA; o ii)un gen que codifica fosfotransbutirilasa, un gen que codifica butiril quinasa y un gen que codifica alcoholdehidrogenasa que reduce 4-hidroxibutirato-CoA.

Mutantes que tienen capacidad de producir 1, 4-butanodiol y procedimiento para la preparación de 1, 4-butanodiol utilizando los mismos Sector técnico La presente invención se refiere a un microorganismo mutante capaz de producir 1, 4-butanodiol y un procedimiento para la preparación de 1, 4-butanodiol utilizando el mismo.

Antecedentes técnicos Se han sugerido los polímeros biodegradables como alternativa a los polímeros sintéticos, que son una de las causas principales de grave contaminación ambiental. Entre los varios polímeros biodegradables que están siendo desarrollados, el poli-β-hidroxibutirato, un polímero biodegradable almacenado por varios microorganismos en estado de nutrición desequilibrada, tiene diferentes características como biodegradabilidad, resistencia al agua, piezoelectricidad y biocompatibilidad. En particular, el 4-hidroxibutirato, que es un ejemplo de polihidroxialcanoato (PHA) tiene características parecidas a un poliéster y muestra un amplio rango de propiedades comprendidas desde las de un plástico cristalino a una goma altamente elástica. Por lo tanto, se están llevando a cabo en la actualidad importantes investigaciones sobre plásticos biodegradables por vía microbiana.

Además, el 4-hidroxibutirato puede ser fácilmente convertido en diferentes productos químicos que tienen 4 átomos de carbono, tales como 1, 4-butanodiol, γ-butirolactona (GBL) y THF. En particular, el 1, 4-butanodiol es un importante producto químico industrial en diferentes formas, tales como polímero, disolvente e intermediario en química fina. Si bien la mayor parte de los productos químicos que tienen 4 átomos de carbono son sintetizados en la actualidad a partir de 1, 4-butanodiol, anhídrido maleico y otros, los crecientes costes de producción provocados por el incremento de precio del petróleo requiere el desarrollo de otro proceso para compensar y sustituir el proceso convencional de producción química. Se ha sugerido como alternativa un proceso biológico.

Como es sabido, el succinato, ácido dicarboxílico con cuatro átomos de carbono, es un tipo de ácido orgánico producido cuando se cultiva un microorganismo en condiciones anaeróbicas. En la actualidad, se están utilizando varios microorganismos como células productoras de succinato y su coste de producción se ha reducido debido a un proceso efectivo de fermentación y al desarrollo de un proceso de separación y purificación. Asimismo, se puede producir 4-hidroxibutirato a partir de succinato y varios ácidos orgánicos que tienen 4 átomos de carbono pueden ser derivados del 4-hidroxibutirato.

La publicación PCT nº WO 2005/052135 es un ejemplo de solicitud de patente que da a conocer un procedimiento para la producción eficaz de succinato, en el que un mutante bacteriano de Rumen produce succinato en alta concentración sin producir otros ácidos orgánicos y un procedimiento de preparación de succinato utilizando el mutante. Además, se da a conocer un procedimiento para la preparación de un mutante de E. coli capaz de producir succinato en alta concentración en la solicitud de patente de Corea nº 10-2004-60149 y un procedimiento para la preparación de succinato utilizando un nuevo gen se da a conocer en las solicitudes de patentes de Corea nº 10-2005-0076301, nº 10-2005-0076317 y nº 10-2005-0076348.

Tal como se ha explicado en lo anterior, existe una elevada demanda de un mutante capaz de producir 1, 4-butanodiol, importante producto químico industrial que tiene 4 átomos de carbono, así como un procedimiento para la preparación de 1, 4-butanodiol.

Materia de la invención Problema técnico La presente invención está dirigida a dar a conocer un microorganismo mutante capaz de producir 1, 4-butanodiol con elevada eficiencia, así como un procedimiento para la preparación de 1, 4-butanodiol utilizando el mismo.

Solución técnica En un aspecto, se introduce o amplifica un microorganismo capaz de producir succinato y preferentemente un mutante que muestra elevada producción de 1, 4 butanodiol, en el que un gen que codifica una enzima que convierte succinato en 4-hidroxibutirato y un gen que codifica una enzima que convierte 4-hidroxibutirato en 1, 4 butanodiol y se da a conocer un procedimiento para la preparación de 1, 4 butanodiol utilizando los mismos, de acuerdo con las reivindicaciones independientes.

Se dan a conocer realizaciones preferentes en las reivindicaciones dependientes.

En otro aspecto, se da a conocer un gen butil-CoA dehidrogenasa de la SEQ ID NO: 8 ó 9, que produce de manera efectiva 1, 4-butanodiol a partir de 4-hidroxibutil-CoA y un vector recombinante que presenta los mismos.

A continuación, se describirá la invención de manera más detallada.

Como resultado de los esfuerzos para preparar 1, 4-butanodiol, utilizando un microorganismo capaz de producir succinato, los presentes inventores han desarrollado un microorganismo mutante que produce 1, 4-butanodiol por inducción o amplificación de un gen asociado con la biosíntesis de 4-hidroxibutirato y/o un gen asociado con la biosíntesis de 1, 4 butanodiol en el microorganismo capaz de producir succinato y han descubierto que el microorganismo mutante produce de manera efectiva 1, 4-butanodiol. Este descubrimiento ha conducido a la presente invención.

El término “amplificación” que se utiliza en esta descripción significa un incremento en el nivel de expresión del gen en comparación con el nivel de expresión original. Si no hay gen que amplificar en un microorganismo antes de mutación, el como mínimo un gen puede ser introducido en el microorganismo y luego puede ser amplificado. Si existe un gen a amplificar en un microorganismo antes de la mutación, el como mínimo un gen puede ser introducido en el microorganismo por el mismo procedimiento descrito anteriormente o bien un gen originalmente presente en el microorganismo puede ser manipulado por una técnica de ingeniería genética para aumentar la expresión del gen. Por ejemplo, cuando una expresión de amplificación de un gen se encuentra presente en un microorganismo a mutar, un promotor original para la realización de la expresión del gen puede ser sustituido por un promotor más potente, amplificando de esta manera la expresión del gen.

El microorganismo capaz de producir succinato puede mostrar una elevada producción de succinato, siendo el microorganismo seleccionado del grupo que consiste en bacterias, por ejemplo, bacteria Rumen, Cor y nebacterium species, Brevibacterium species y E. coli.

La bacteria Rumen puede tener un gen en activo que codifica lactato dehidrogenasa (ldhA) y piruvato-formato liasa (pfl) y produce succinato en alta concentración sin otros ácidos orgánicos en condiciones anaeróbicas.

El término “inactivación” que se utiliza en esta descripción significa que un gen no es transcrito debido a mutación o que el ARNm transcrito no ha sido traducido apropiadamente en la proteína original. Para desactivar un gen, la mutación puede ser llevada a cabo prescindiendo de un gen o cambiando una secuencia de ácido nucleico de un gen.

Además, la bacteria Rumen puede tener genes inactivos que codifican lactato dehidrogenasa (ldhA) , piruvato formato liasa (pfl) , fosfotransacetilasa (pta) y acetato quinasa (ackA) y producen succinato en elevada concentración sin sustancial producción de otros ácidos orgánicos en condiciones anaeróbicas.

De manera alternativa, la bacteria Rumen puede tener genes inactivos que codifican lactato dehidrogenasa (ldhA) , piruvato-formato liasa (pfl) y fosfopiruvato carboxilasa (ppc) y producen succinato en elevada concentración sin producción sustancial de otros ácidos orgánicos en situación anaeróbica.

La bacteria Rumen puede ser seleccionada a través del grupo que consiste en Mannheimia sp., Actinobacillus sp. y Anaerobiospirllum sp., pero la presente invención no está limitada a estos ejemplos. Es preferible Mannheimia sp. y Mannheimia succiniciproducens MBEL55E (KCTC 0769BP) , Mannheimia sp. LPK (KCTC 10558BP) , LPK4 y LPK7 (KCTC 10626BP) son más preferibles.

La E. coli puede tener genes inactivos que codifican glucosa fosfotransferasa (ptsG) y piruvato quinasa (pykA y pykF) , y producen succinato en alta concentración sin producción sustancial de otros ácidos orgánicos en estado anaeróbico. En particular, el mutante de E. coli es preferentemente W3110GFA que se ha dado a conocer en la publicación de patente de Corea nº 10-2006-0011345.

Entre los microorganismos antes mencionados que producen succinato en alta concentración la bacteria Rumen puede ser preparada según un procedimiento que se da a conocer en la publicación PCT nº WO 2005/052135. Es decir, un gen de dehidrogenasa... [Seguir leyendo]

1. Mutante que muestra elevada producción de 1, 4-butanodiol, que es preparado introduciendo o amplificando genes que codifican enzimas que convierten succinato en 4-hidroxibutirato y 4-hidroxibutirato en 1, 4-butanodiol, en un microorganismo capaz de producir succinato,

en el que el microorganismo capaz de producir succinato es una bacteria,

el gen que codifica la enzima que convierte succinato en 4-hidroxibutirato es seleccionado del grupo que consiste en genes que codifican succinil-CoA transferasa, semialdehído de succinato dehidrogenasa, 4-hidroxibutirato dehidrogenasa y 4-hidroxibutirato dehidrogenasa, y

el gen que codifica la enzima que convierte 4-hidroxibutirato en 1, 4-butanodiol es i) un gen que codifica 4hidroxibutirato-CoA transferasa y un gen que codifica alcohol dehidrogenasa que reduce 4-hidroxibutirato-CoA; o ii) un gen que codifica fosfotransbutirilasa, un gen que codifica butiril quinasa y un gen que codifica alcohol dehidrogenasa que reduce 4-hidroxibutirato-CoA.

2. Mutante, según la reivindicación 1, en el que la bacteria es seleccionada entre el grupo que consiste en bacteria Rumen, Cor y nebacterium species, Brevibacterium species y E. coli.

3. Mutante, según la reivindicación 2, en el que la bacteria Rumen tiene genes inactivos que codifican i) lactato dehidrogenasa (ldhA) y piruvato-formato liase (pfl) ; ii) lactato dehidrogenasa (ldhA) , piruvato-formato liasa (Pfl) , fosfotransacetilasa (pta) y acetato quinasa (ackA) ; o (iii) lactato dehidrogenasa (ldhA) , piruvato-formato liasa (Pfl) y fosfopiruvato carboxilasa (Ppc) , y producen succinato con elevada concentración sin producción sustancial de otros ácidos orgánicos en condiciones anaeróbicas.

4. Mutante, según la reivinidcación 2 ó 3, en el que la bacteria Rumen es seleccionada entre el grupo que consiste en Mannheimia species, Actinobacillus species y Anaerobiospirillum species.

5. Mutante, según la reivindicación 4, en el que la bacteria Rumen es seleccionada entre el grupo que consiste en Mannheimia succiniciproducens MBEL55E (KCTC 0769BP) y Mannheimia species LPK (KCTC 10558BP) , LPK4 y LPK7 (KCTC 10626BP) .

6. Mutante, según la reivindicación 2, en el que el E. coli tiene genes inactivos que codifican fosfotransferasa (ptsG) y piruvato quinasa (pykA y pykF) , y producen succinato en la concentración sin reducción sustancial de otros ácidos orgánicos en condiciones anaeróbicas.

7. Mutante, según la reivindicación 6, en el que el mutante de E. coli es W3110GFA.

8. Mutante, según la reivindicación 1, en el que el gen que codifica la enzima que convierte succinato en 4hidroxibutirato se deriva de Clostridium kluyveri.

9. Mutante, según la reivindicación 1, en el que el gen que codifica la enzima que convierte 4-hidroxibutirato en 1, 4butanodiol se deriva de Clostridium acetobutylicum.

10. Mutante, según la reivindicación 1, en el que el alcohol dehidrogenasa es butil-CoA dehidrogenasa derivado de Clostridium acetobutylicum.

11. Mutante, según la reivindicación 1, en el que el mutante tiene un gen inactivo asociado con la conversión de semialdehído de succinato en succinato.

12. Mutante, según la reivindicación 1, en el que el gen asociado con la conversión de semialdehído de succinato en succinato es un gen que codifica semialdehído succínico dehidrogenasa.

13. Mutante, según la reivindicación 1, en el que un gen que codifica la proteína de transporte de C4-dicarboxilato (DctA) , asociado con el transporte de succinato es introducida adicionalmente o amplificada en el mutante.

14. Método para la preparación de 1, 4-butanodiol, que comprende:

recultivar el mutante según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 13 en un medio que contiene una fuente de carbono, y

obtener 1, 4-butanodiol del medio.