Un anticuerpo monoclonal humano capaz de unirse específicamente a CD1a humano,

caracterizado por que el anticuerpo monoclonal humano comprende una región variable de cadena pesada que comprende la secuencia de aminoácidos de la SEC ID N.º: 8 y una región variable de cadena ligera que comprende la SEC ID N.º: 20.

Molécula de unión humana contra CD1a

Campo de la invención

La invención se refiere a la identificación de moléculas de unión humanas capaces de unirse específicamente a CD1a, a inmunoconjugados que comprenden estas moléculas de unión y a procedimientos de obtención de las moléculas de unión. La invención comprende además el uso de las moléculas de unión humanas en medicina, en concreto para el diagnóstico, prevención y/o tratamiento de enfermedades neoplásicas e histiocitosis de células de Langerhans.

Antecedentes de la invención

Las moléculas CD1 son una familia de moléculas que se expresan en las superficies de células dendríticas, monocitos y algunos timocitos. Las moléculas CD1 son similares a las moléculas MHC de clase I en cuanto que están implicadas en presentación de antígenos. Hasta el momento se han identificado cinco genes de CD1 en seres humanos: CD1a, CD1b, CD1c, CD1d y CD1e. Los productos de cuatro de estos cinco genes CD1 han sido definidos serológicamente. Se denominan CD1a, CD1b, CD1c y CD1d y se distinguen por cadenas pesadas únicas con pesos moleculares aproximados de 49kDa, 45kDa, 43kDa y 48kDa, respectivamente.

El hecho de que moléculas CD1 sean expresadas por células de leucemia agua y crónica de los linajes pre-B, B, T y no linfoide hace que las CD1a sean en principio un objetivo para detectar o atacar estas enfermedades (Salamone y col. (1990a) , Salamone (1990b) , Merle-Beral y col. (1989) ) .

Además, las moléculas CD1a están presentes sobre células de Langerhans (las cuales son las principales células dendríticas presentadoras de antígeno de la piel) (Teunissen (1992) ) . Esto hace a las CD1a en principio un objetivo para detectar o tratar la histiocitosis de células de Langerhans (LCH) , una neoplasia proliferativa clonal con manifestaciones clínicas variables, que van desde lesiones autolimitadas aisladas hasta enfermedad multisistémica que puede poner en peligro la vida.

Las moléculas de unión que se unen específicamente a CD1 pueden ser muy útiles en el diagnóstico y el tratamiento de los trastornos mencionados anteriormente. Se conocen en la técnica varios anticuerpos monoclonales murinos dirigidos contra CD1 (Kelly (1994) , Amiot y col. (1986) , Furue y col. (1992) ) . Además, Moulon y col. ( (J. Invest. Dermatol. 97:524-528, 1991) han divulgado diferentes anticuerpos monoclonales murinos anti-CD1a que reconocen diferentes epítopos de CD1a sobre la superficie de células de Langerhans. Murray y col. (J. Invest. Dermatol. 114:127-134, 2001) han investigado el potencial de uno de estos anticuerpos murinos anti-CD1a en el diagnóstico y tratamiento de un modelo de histiocitosis de células de Langerhans. Sin embargo, los anticuerpos murinos, en formato desnudo o inmunoconjugado, tienen un uso limitado in vivo debido a los problemas asociados con la administración de anticuerpos murinos a seres humanos, tales como una semivida en suero corta , una incapacidad de desencadenar determinadas funciones efectoras humanas y provocación de una respuesta inmunitaria drástica no deseada contra el anticuerpo murino en un ser humano (la reacción "humana anti-anticuerpo de ratón" (HAMA) ) (van Kroonenburgh y Pauweis (1988) ) .

En general, los intentos de superar los problemas asociados con el uso de anticuerpos totalmente murinos en seres humanos, han implicado modificar genéticamente los anticuerpos para que sean más "de tipo humano". Una Cebadora etapa del procedimiento de humanización fue preparar anticuerpos quiméricos, es decir, anticuerpos en los que las regiones variables de las cadenas de los anticuerpos son de origen murino y las regiones constantes de las cadenas de los anticuerpos son de origen humano. Posteriormente, los dominios entre los dominios variables que especifican la unión al antígeno fueron reemplazados por sus correspondientes humanos, conduciendo a los denominados anticuerpos humanizados. Una desventaja de estos anticuerpos quiméricos y humanizados es que aún retienen algunas secuencias murinas y, por lo tanto, aún provocan una reacción inmunitaria no deseada, especialmente cuando se administran durante periodos de tiempo prolongados.

En vista de su beneficio en tratamientos, existe aún una necesidad de moléculas de unión humanas contra CD1a.

La presente invención proporciona moléculas de unión humanas contra CD1a que pueden usarse en medicina, en concreto para diagnóstico, prevención y/o tratamiento de trastornos asociados con CD1a.

Descripción de las figuras Figura 1. Aislamiento de monocitos y diferenciación de monocitos en células dendríticas inmaduras (CD) mediante IL-4 y GM-CSF y en DC maduras mediante un cóctel adicional que contiene IL-1º, IL-6, TNF-a, PGE2. En las imágenes de FACS se indica una mezcla de LSP, usada como células sustractoras durante la selección de fagos, y DC cultivadas (en el recuadro) , en la que la cantidad de PBL es aproximadamente 10 veces la cantidad de CD.

Figura 2. El análisis por FACS de la unión de un anticuerpo en fago monoclonal representativo (llamado SC02-113) a DC cultivadas inmaduras (arriba, izquierda) y maduras (arriba, derecha) y un transfectante CD1a en células C1R (abajo, derecha) , comparado con el control negativo de C1R con transfección simulada (abajo, izquierda) .

Figura 3. Unión de los anticuerpos monoclonales humanos anti-CD1a humanas llamados CR2113, CR2114, CR2115, CR2116, CR2117 y CR2118 y anticuerpos de ratón anti-CD1a humanas, anticuerpos de ratón anti-CD1b humanas, anticuerpos de ratón anti-CD1c humanas y anticuerpos de ratón anti-CD1d humanas comercialmente disponibles a los transfectantes CR1-CD1a y B16-CD1a y transfectantes simulados de CR1 y B16. La unión significativa de anticuerpos monoclonales humanos anti-CD1a humanas a transfectantes de CD1a comparada con los transfectantes simulados se indica con **. La significancia se ensayó con una prueba de la t no pareada de dos colas (p<0, 05) .

Figura 4. Unión de los anticuerpos monoclonales humanos anti-CD1a humanas llamados CR2113, CR2114, CR2115, CR2116, CR2117 y CR2118 y anticuerpos de ratón anti-CD1a humanas, anticuerpos de ratón anti-CD1b humana, anticuerpos de ratón anti-CD1c humana y anticuerpos de ratón anti-CD1d humana a los transfectantes CR1-CD1b, CR1-CD1c y CR1-CD1d. La unión significativa de anticuerpos monoclonales humanos anti-CD1a humanas a los transfectantes CR1-CD1b, CR1-CD1c o CR1-CD1d comparada con los transfectantes simulados de CR1 se indica con **. La significancia se ensayó con una prueba de la t no pareada de dos colas (p<0, 05) .

Figura 5. Las Figuras 5A-D muestran curvas de anticuerpos monoclonales humanos anti-CD1a humanas no marcados y marcados con biotina llamados CR2113, CR2114, CR2117 y CR2118 en transfectantes B16-CD1a.

Figura 6. Las Figuras 6A-D muestran curvas de competición para CR2113, CR2114, CR2117 y CR2118 frente a anticuerpos monoclonales humanos anti-CD1a humanas.

Descripción de la invención A continuación se presentan definiciones de términos/expresiones como se usan en la invención.

Definiciones

Leucemia mieloide aguda

Como se usa en el presente documento, la expresión "leucemia mieloide aguda" se caracteriza por una proliferación descontrolada de células progenitoras de origen mieloide incluyendo, pero sin limitarse a, células progenitoras mieloides, células progenitoras mielomonocíticas, megacarioblastos inmaduros. Los subtipos de leucemia mieloide aguda (AML) incluyen, de acuerdo con la clasificación FAB, FAB-M0, FAB-M1, FAB-M2, FAB-M3, FAB-M4, FAB-M5, FAB-M6 y FAB-M7.

Secuencia de aminoácidos

La expresión "secuencia de aminoácidos" como se usa en el presente documento se refiere a moléculas naturales o sintéticas y a una secuencia de un péptido, oligopéptido, polipéptido o proteína.

Apoptosis Como se usa en el presente documento, el término "apoptosis" se refiere a cualquier muerte celular, ordenada o controlada que resulta de la compleja cascada de acontecimientos celulares que se producen en etapas específicas de la diferenciación celular y en respuesta a estímulos específicos. La apoptosis se caracteriza y/o está acompañada por uno o más cambios celulares característicos, incluyendo, pero sin limitarse a, condensación del citoplasma, pérdida de microvellosidades de la membrana plasmática, segmentación del núcleo, degradación de ADN cromosómico o pérdida de función mitocondrial. La apoptosis puede determinarse y medirse, por ejemplo, mediante ensayos de viabilidad... [Seguir leyendo]

1. Un anticuerpo monoclonal humano capaz de unirse específicamente a CD1a humano, caracterizado por que el anticuerpo monoclonal humano comprende una región variable de cadena pesada que comprende la secuencia de aminoácidos de la SEC ID Nº : 8 y una región variable de cadena ligera que comprende la SEC ID Nº : 20.

2. Un anticuerpo monoclonal humano de acuerdo con la reivindicación 1, caracterizado por que el anticuerpo es una IgG1.

3. Un anticuerpo monoclonal humano de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1 - 2, caracterizado por que el anticuerpo tiene al menos una actividad seleccionada del grupo que consiste en citotoxicidad celular mediada por anticuerpos, citotoxicidad dependiente del complemente e internalización.

4. Un inmunoconjugado que comprenden un anticuerpo monoclonal humano de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1 - 3, comprendiendo además el inmunoconjugado al menos un marcador.

5. Un inmunoconjugado de acuerdo con la reivindicación 4, caracterizado por que el marcador se selecciona del grupo que consisten en una sustancia tóxica, una sustancia radioactiva, un liposoma, una enzima y sus combinaciones.

6. Una molécula de ácido nucleico que codifica un anticuerpo monoclonal humano de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1 - 3.

7. Un vector que comprende al menos una molécula de ácido nucleico de acuerdo con la reivindicación 6.

8. Una célula huésped que comprende al menos un vector de acuerdo con la reivindicación 7.

9. Una célula huésped de acuerdo con la reivindicación 8, caracterizada por que la célula huésped es una célula humana.

10. Un procedimiento para producir un anticuerpo monoclonal humano de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1 - 3, en el que el procedimiento comprende las etapas de:

a) cultivar una célula huésped de acuerdo con la reivindicación 8 ó 9 bajo condiciones que conducen a la expresión del anticuerpo monoclonal y, opcionalmente, b) recuperar el anticuerpo monoclonal humano expresado.

11. Una composición que comprende un anticuerpo monoclonal humano de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1 - 3 o un inmunoconjugado de acuerdo con la reivindicación 4 ó 5.

12. Una composición farmacéutica que comprende un anticuerpo monoclonal humano de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 - 3, un inmunoconjugado de acuerdo con la reivindicación 4 ó 5 o una composición de acuerdo con la reivindicación 11, comprendiendo además la composición farmacéutica al menos un excipiente farmacéuticamente aceptable.

13. Una composición farmacéutica de acuerdo con la reivindicación 12, que comprende además al menos otro agente terapéutico.

14. Un anticuerpo monoclonal humano de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 -3, un inmunoconjugado de acuerdo con la reivindicación 4 ó 5, una composición de acuerdo con la reivindicación 11 o una composición farmacéutica de acuerdo con la reivindicación 12 ó 13 para su uso como un medicamento.

15. Un procedimiento para detectar CD1a humanas, en el que el procedimiento comprende las etapas de:

a. poner en contacto una muestra con una cantidad diagnósticamente eficaz de un anticuerpo monoclonal humano de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1 - 3 o un inmunoconjugado de acuerdo con la reivindicación 4 o 5 y

b. determinar si el anticuerpo monoclonal humano o el inmunoconjugado se unen específicamente a un compuesto de la muestra.

Día 5 CD cultivadas

IL-4 + GM-CSF

inmaduras monocitos

CD83

Ficoll formación de rosetas de SRBC

IL-1f, IL-6, TNF-a, PGE2

no adherencia Granulocitos

-

Día 7 Linfocitos T

CD cultivadas Linfocitos B

maduras Células NK

CD1A

FIGURA 1

FIGURA 2