El uso de una composición que comprende una población concentrada de células derivadas de tejido adiposo (ADC) en la fabricación de un medicamento para restablecer el flujo sanguíneo en un sujeto que se ha determinado que tiene una isquemia,

en el que dicha población concentrada de células derivadas de tejido adiposo (ADC) com- prende células progenitoras derivadas de tejido adiposo y células madre de tejido adiposo obtenidas procesando el tejido adiposo de dicho paciente en un sistema que está configurado para mantener una ruta de fluido/tejido cerrada estéril, y dicho sistema comprende una cámara de recogida conectada a una cámara de mezcla/procesamiento

Metodos para usar celulas derivadas de tejido adiposo en el tratamiento de afecciones cardiovasculares ANTECEDENTES DE LA INVENCION

1. Campo de la Invenci6n

Esta invenci6n se refiere en general al uso de una composici6n que comprende una poblaci6n concentrada de celulas derivadas de tejido adiposo (ADC) en la fabricaci6n de un medicamento para restablecer el flujo sangufneo en un sujeto que se ha determinado que tiene una isquemia, en la que dicha poblaci6n concentrada de celulas derivadas de tejido adiposo (ADC) comprende celulas progenitoras derivadas de tejido adiposo y celulas madre de tejido adiposo obtenidas procesando el tejido adiposo de dicho paciente en un sistema que esta configurado para mantener una ruta de fluidos/tejidos cerrada esteril, y dicho sistema comprende una camara de recogida conectada a una camara de mezcla/procesamiento.

2. Descripci6n de la Tecnica Relacionada

Las enfermedades y trastornos cardiovasculares son la causa principal de muerte y discapacidad en todas las na

ciones industrializadas. Solamente en los Estados Unidos, la enfermedad cardiovascular es responsable de alrede

dor del 40 por ciento de la tasa de mortalidad, y afecta a 58 millones de americanos (AmericanHeartAssociation, 2002) . Uno de los factores principales que hace que la enfermedad cardiovascular sea especialmente devastadora es la incapacidad del coraz6n de repararse tras la lesi6n. Debido a que las celulas musculares cardiacas, es decir, las celulas miocardicas, son incapaces de dividirse y repoblar las areas lesionadas, la perdida de celulas cardiacas como resultado de la lesi6n o la enfermedad es en gran parte irreversible (Abbate et al, 2002; Remme, 2000) .

De las formas disponibles de terapia, los trasplantes de coraz6n de ser humano a ser humano han sido las mas eficaces para tratar las enfermedades y trastornos cardiovasculares graves. De hecho, actualmente la tasa de supervivencia a un ano y cinco anos del receptor de trasplante cardiaco medio es superior al 70 por ciento. Desafortunadamente, sin embargo, el trasplante es una forma gravemente limitada de terapia por varias razones, concretamente, la escasez de donantes adecuados, el coste del procedimiento y la probabilidad elevada de rechazo del injerto y problemas asociados tales como infecciones, disfunci6n renal y canceres relacionados con los inmunodepresores (AmericanHeartAssociation, 2002) .

Una alternativa a la terapia de trasplante es el uso de la medicina regenerativa para reparar y regenerar las celulas musculares cardiacas danadas. La medicina regenerativa aprovecha, de una manera dirigida clfnicamente, la capacidad de las celulas madre (es decir, las celulas maestras sin especializar del cuerpo) de renovarse indefinidamente y desarrollarse hasta celulas especializadas maduras. Las celulas madre se hallan en los embriones durante las etapas tempranas del desarrollo, en el tejido fetal y en algunos 6rganos y tejidos adultos (Pera et al., 2000) . Se sabe que las celulas madre embrionarias (denominadas mas adelante en la presente memoria "ESCs") se convierten en muchos, si no todos, los tipos de celulas y tejidos del cuerpo. Las ESCs no solamente contienen toda la informaci6n genetica del individuo, sino que tambien contienen la capacidad nata de convertirse en cualquiera de las mas de 200

celulas y tejidos del cuerpo. Asf, estas celulas tienen un potencial enorme para la medicina regenerativa. Por ejemplo, las ESCs se pueden cultivar hasta tejidos especfficos tales como coraz6n, pulm6n o rin6n, que se podrfan usar despues para reparar 6rganos lesionados y enfermos (Assady et al., 2001; Jacobson et al., 2001; Odorico et al., 2001) . Sin embargo, los tejidos derivados de ESCs tienen limitaciones clfnicas. Debido a que las ESCs derivan necesariamente de otro individuo, es decir, un embri6n, existe el riesgo de que el sistema inmunitario del receptor re

chace el material biol6gico nuevo. Aunque hay disponibles farmacos inmunodepresores para evitar dicho rechazo, se sabe que tales farmacos tambien bloquean respuestas inmunitarias deseables, tales como hacia las infecciones bacterianas y virus. Ademas, el debate etico sobre la fuente de las ESCs, es decir, los embriones, esta bien documentado y presenta un obstaculo adicional y, quizas, insuperable para un futuro previsible.

Las celulas madre de adulto (denominadas de forma intercambiable "ASCs" mas adelante en la presente memoria)

45 representan una alternativa al uso de ESCs. Las ASCs residen discretamente en muchos tejidos no embrionarios, supuestamente esperando para responder a traumatismos u otros procesos patol6gicos destructivos, de manera que puedan curar el tejido lesionado (Arvidsson et al., 2002; BonnerWeir y Sharma, 2002; Clarke y Frisen, 2001; Crosby y Strain, 2001; Jiang et al., 2002a) . Notablemente, las pruebas cientfficas emergentes indican que cada individuo porta un grupo de ASCs que pueden compartir con las ESCs la capacidad de convertirse en muchos, si no en todos, 50 los tipos de celulas y tejidos (Young et al., 2001; Jiang et al., 2002a; Jiang et al., 2002b; Schwartz et al., 2002) . Asf, las ASCs, como las ESCs, tienen un potencial enorme para las aplicaciones clfnicas de la medicina regenerativa.

Se ha demostrado que las poblaciones de ASCs estan presentes en uno o mas de medula 6sea, piel, musculo, hfgado y cerebro (Jiang et al., 2002b; Alison, 1998; Crosby y Strain, 2001) . Sin embargo, la frecuencia de ASCs en estos tejidos es baja. Por ejemplo, se estima que la frecuencia de las celulas madre mesenquimatosas en la medula 55 6sea es entre 1 en 100.000 y 1 en 1.000.000 de celulas nucleadas (D'Ippolito et al., 1999; Banfi et al., 2001; Falla et al., 1993) . De forma similar, la extracci6n de ASCs de la piel implica una serie complicada de etapas de cultivo celular durante varias semanas (Toma et al., 2001) y la aplicaci6n clfnica de ASCs derivadas de musculo esqueletico requiere una fase de cultivo de dos a tres semanas (Hagege et al., 2003) . Asf, cualquier aplicaci6n clfnica propuesta

de las ASCs a partir de tales tejidos requiere incrementar el numero de celulas, la pureza y la madurez mediante procedimientos de purificaci6n celular y de cultivo celular.

Aunque las etapas de cultivo celular pueden proporcionar un numero de celulas, pureza y madurez incrementadas, lo hacen con cierto coste. Este coste puede incluir una o mas de las siguientes dificultades tecnicas: perdida de la funci6n celular debido al envejecimiento celular, perdida de poblaciones de celulas que no son celulas madre potencialmente utiles, retrasos en la aplicaci6n potencial de las celulas a los pacientes, coste econ6mico incrementado y riesgo incrementado de contaminaci6n de las celulas con microorganismos ambientales durante el cultivo. Los estudios recientes que examinan los efectos terapeuticos de ASCs derivadas de medula 6sea han usado esencialmente medula 6sea completa para evitar los problemas asociados al cultivo celular (Horwitz et al., 2001; Orlic et al., 2001; Stamm et al., 2003; Strauer et al., 2002) . Los beneficios clfnicos, sin embargo, han sido sub6ptimos, un resultado relacionado casi con toda seguridad con la dosis y pureza limitadas de las ASCs disponibles intrfnsecamente en la medula 6sea.

Recientemente, se ha demostrado que el tejido adiposo es una fuente de ASCs (Zuk et al., 2001; Zuk et al., 2002) . El documento WO 00/53795 describe celulas madre derivadas de tejido adiposo y mallas, p.ej. celulas madre derivadas de tejido adiposo sustancialmente exentas de adipocitos y eritrocitos sangufneos y poblaciones clonales de celulas madre de tejido conectivo. Las celulas se pueden emplear, solas o en composiciones biol6gicamente compatibles, para generar tejidos y estructuras diferenciadas, tanto in vivo como in vitro. A diferencia de la medula 6sea, la piel, el musculo, el hfgado y el cerebro, el tejido adiposo es comparativamente facil de recoger en cantidades relativamente grandes (Commons et al., 2001; Katz et al., 2001b) . Ademas, se ha mostrado que las ASCs derivadas de tejido adiposo poseen la capacidad de generar multiples tejidos in vitro, lo que incluye hueso, grasa, cartflago y musculo (Ashjian et al., 2003; Mizuno et al., 2002; Zuk et al., 2001; Zuk et al., 2002) . Asf, el tejido adiposo representa una fuente 6ptima de ASCs para su uso en la medicina regenerativa. Los metodos adecuados para recoger ASCs derivadas de tejido adiposo, sin embargo, son escasos en la tecnica. Los metodos existentes poseen varios defectos. Por ejemplo, los metodos existentes carecen de la capacidad de acomodar de forma 6ptima un dispositivo de aspiraci6n... [Seguir leyendo]

1. El uso de una composici6n que comprende una poblaci6n concentrada de celulas derivadas de tejido adiposo (ADC) en la fabricaci6n de un medicamento para restablecer el flujo sangufneo en un sujeto que se ha determinado que tiene una isquemia, en el que dicha poblaci6n concentrada de celulas derivadas de tejido adiposo (ADC) comprende celulas progenitoras derivadas de tejido adiposo y celulas madre de tejido adiposo obtenidas procesando el tejido adiposo de dicho paciente en un sistema que esta configurado para mantener una ruta de fluido/tejido cerrada esteril, y dicho sistema comprende una camara de recogida conectada a una camara de mezcla/procesamiento.

2. El uso de acuerdo con la reivindicaci6n 1, en el que dicha poblaci6n concentrada de celulas comprende al menos 500 celulas progenitoras endoteliales/mill6n de celulas derivadas de tejido adiposo.

3. El uso de acuerdo con la reivindicaci6n 1, en el que dicha afecci6n isquemica comprende la insuficiencia cardiaca congestiva.

4. El uso de acuerdo con la reivindicaci6n 1, en el que dicha afecci6n isquemica es infarto de miocardio.

5. El uso de acuerdo con la reivindicaci6n 1, en el que dicho sujeto es diabetico.

6. El uso de acuerdo con la reivindicaci6n 1, en el que dicho sujeto es obeso.

7. El uso de acuerdo con la reivindicaci6n 1, en el que dicha composici6n comprende una inyecci6n rapida de dichas celulas derivadas de tejido adiposo.

8. El uso de acuerdo con la reivindicaci6n 1, en el que dicha composici6n proporciona entre 55.000 y 550.000 celulas madre derivadas de tejido adiposo.

9. El uso de acuerdo con la reivindicaci6n 1, en el que dicha composici6n comprende ademas uno o mas factores angiogenicos.

10. El uso de acuerdo con la reivindicaci6n 1, en el que dicha poblaci6n de celulas se caracteriza por tener expresi6n del factor de crecimiento endotelial vascular (VEGF) cuando se cultiva.

11. El uso de acuerdo con la reivindicaci6n 1, en el que dicha poblaci6n de celulas se caracteriza por tener expresi6n del factor de crecimiento de placenta (PLGF) cuando se cultiva.

12. El uso de acuerdo con la reivindicaci6n 1, en el que dicha composici6n comprende ademas uno o mas factores arteriogenicos.

13. El uso de acuerdo con la reivindicaci6n 1, en el que dicha composici6n comprende ademas uno o mas factores inmunodepresores.

14. El uso de acuerdo con la reivindicaci6n 1, en el que dichas celulas derivadas de tejido adiposo no se cultivan en un cultivo.

15. El uso de acuerdo con la reivindicaci6n 1, en el que dichas celulas derivadas de tejido adiposo se cultivan en un cultivo celular.

16. El uso de acuerdo con la reivindicaci6n 15, en el que dichas celulas derivadas de tejido adiposo se cultivan en condiciones de cultivo que favorecen la diferenciaci6n hacia un fenotipo miocftico.

17. El uso de acuerdo con la reivindicaci6n 16, en el que dicho fenotipo miocftico es un fenotipo miocftico cardiaco.

18. El uso de acuerdo con la reivindicaci6n 16, en el que dicho fenotipo miocftico es un fenotipo miocftico esqueletico.

19. El uso de acuerdo con la reivindicaci6n 16, en el que dicho fenotipo miocftico es un fenotipo miocftico de musculo liso vascular.

20. El uso de acuerdo con la reivindicaci6n 15, en el que dichas celulas derivadas de tejido adiposo se cultivan en condiciones de cultivo que favorecen la diferenciaci6n hacia un fenotipo endotelial.

21. El uso de acuerdo con la reivindicaci6n 15, en el que dicho cultivo celular se lleva a cabo en un material de soporte para generar una construcci6n bidimensional o tridimensional que se puede colocar sobre o dentro del coraz6n.

22. El uso de acuerdo con la reivindicaci6n 21, en el que dicho material de soporte es reabsorbible in vivo.

23. El uso de acuerdo con la reivindicaci6n 1, en el que las celulas progenitoras endoteliales derivadas de tejido adiposo se modifican mediante transferencia genica.

24. El uso de acuerdo con la reivindicaci6n 23, en el que dicha modificaci6n altera la angiogenesis.

25. El uso de acuerdo con la reivindicaci6n 23, en el que dicha modificaci6n altera la arteriogenesis.

26. El uso de acuerdo con la reivindicaci6n 23, en el que dicha modificaci6n altera la apoptosis.

27. El uso de acuerdo con la reivindicaci6n 26, en el que dichas celulas progenitoras endoteliales derivadas de tejido adiposo modificadas se pueden diferenciar hasta miocitos cardiacos con una apoptosis alterada.

28. El uso de acuerdo con la reivindicaci6n 23, en el que dicha modificaci6n altera las propiedades de guiado de dichas celulas derivadas de tejido adiposo.

Expresion de VEGF 'pg 106 celulasi

Expresion de VEGF por ADC

Don. Normal 1 Don. Normal 2 Diabetico Expresion de PIGF 'pg 106 celulasi

Expresion de PIGF por ADC

Don. Normal 1 Don. Normal 2 Diabetico ID del Donante ID del Donante

FIGURA 6

Figura 6: Tinci6n con UEA1 de una colonia de EPC derivadas de ADC

FIGURA 8

Flujo medio de sangre en el modelo de isquemia de las extremidades posteriores en ratones SCID tratados con PLA de humano diabetico

Porcentaje de ;lujo Contr. Neg. Trat. con PLA