Un método de enriquecimiento de una población de células en aquellas células que producen un anticuerpo quereconoce un antígeno de interés,

que comprende:

a) la puesta en contacto de dicha población con un anticuerpo que reconoce CD5, CD9, CD10, CD19, CD20, CD21,CD22, CD45 o CD45 RC, uniéndose dicho anticuerpo a un primer marcador fluorescente,

b) la puesta en contacto de dicha población con un antígeno de interés que está sin marcar,

c) la puesta en contacto de dicha población con una muestra que comprende un anticuerpo policlonal que reconoceespecíficamente dicho antígeno, uniéndose dicho anticuerpo policlonal a un segundo marcador fluorescente, y

d) la separación de la población de aquellas células que se pueden detectar por estar asociadas con el primer ysegundo marcadores fluorescentes;

en donde la parte b) se lleva a cabo antes de las partes a) y c), y en donde a la parte b) le sigue una etapa delavado.

Métodos para obtener anticuerpos La presente invención se refiere a métodos mejorados para la selección de células que producen anticuerpos específicos para un antígeno de interés.

Los anticuerpos son una clase particular de proteínas que se han desarrollado con fines terapéuticos y diagnósticos. Históricamente, el aislamiento de células que producen anticuerpos específicos para un antígeno de interés se ha realizado utilizando la tecnología de hibridoma. Otros métodos incluyen el aislamiento de anticuerpos procedentes de librerías expresadas en bacterias que están limitados por: (i) restricciones con los límites prácticos del tamaño de las librerías; y (ii) la necesidad de que el anticuerpo se exprese y se pliegue adecuadamente en la bacteria. Se han diseñado una serie de métodos alternativos para permitir que los anticuerpos de alta afinidad generados durante la respuesta inmunitaria in vivo se puedan aislar en cualquier especie (Babcook y col., 1996, Proc. Natl. Acad. Sci, 93,

15 7843-7848; WO 92/02551; de Wildt y col., 1997, J. Immunol. Methods, 207:61-67 y en Lagerkvist, y col., 1995, BioTechniques 18 (5) :862-869) .

El documento US 5.326.696 describe métodos de tinción con inmunofluorescencia en los que cada antígeno de interés se marca con un fluorocromo diferente. El documento WO 94/09117 describe el marcaje de células con los productos que segregan ellas mismas acoplando las células a su superficie mediante un biomarcador de superficie específico a un par de unión específico para el producto y a continuación permitiendo que el producto sea capturado por el par de unión específico a medida que es segregado y liberado.

Los métodos para la detección y el aislamiento de células que producen anticuerpos específicos para un antígeno de interés son muy conocidos en la materia e incluyen el aislamiento de células que producen anticuerpos mediante la unión a un antígeno biotinilado y la captura sobre cuentas de estreptavidina, ciclos de selección de fagos por afinidad contra superficies plásticas recubiertas de antígeno, la formación de rosetas con glóbulos rojos recubiertos de antígeno, análisis de citometría de flujo y clasificación de células únicas en donde el antígeno está marcado con fluorescencia. El mayor inconveniente de estos métodos es que la presentación de antígeno normalmente es aleatoria de manera que se puede producir el enmascaramiento del epítopo antigénico, que es reconocido específicamente por el anticuerpo producido por la célula. En particular, cuando el antígeno de interés sea una proteína, el marcaje del antígeno, por ejemplo con un marcador fluorescente, es una modificación química de la superficie del antígeno que puede reducir la afinidad de una interacción anticuerpo-antígeno o evitar dicha interacción. Cuando los antígenos de interés sean proteínas pequeñas o péptidos cortos, la introducción de una modificación química en forma de marcador, tal como un marcador fluorescente, puede interferir de manera que se produzca poca o ninguna unión del antígeno con el anticuerpo específico.

Existen problemas similares cuando el antígeno de interés se proporciona marcado en forma de proteína de fusión. La incorporación de una secuencia adicional en el C-término o en el N-término de una proteína puede producir un plegamiento aberrante de forma que el antígeno no se pliegue en una conformación nativa. Como tal, los epítopos antigénicos expuestos en, por ejemplo, un hospedador inmunizado con un antígeno nativo pueden no estar accesibles en una proteína de fusión del mismo antígeno. Así, en la etapa de enriquecimiento de las células que producen anticuerpos específicos para el antígeno nativo, las células que producen anticuerpos para epítopos que están enmascarados o alterados en la proteína de fusión no se detectarán y no podrán ser aisladas.

45 Por tanto la utilización de un antígeno no marcado o no marcado es particularmente ventajosa puesto que evita cualquier modificación del antígeno que pueda modificar o enmascarar los sitios de interacción y que, a su vez, pueda producir que no se consiga detectar un anticuerpo específico para el antígeno de interés. Por consiguiente, se proporciona un método de enriquecimiento de una población de células en aquellas células que producen un anticuerpo que reconoce un antígeno de interés, que comprende:

a) la puesta en contacto de dicha población con un anticuerpo que reconoce CD5, CD9, CD10, CD19, CD20, CD21, CD22, CD45 o CD45 RC, uniéndose dicho anticuerpo a un primer marcador fluorescente;

55 b) la puesta en contacto de dicha población con un antígeno de interés que está sin marcar;

c) la puesta en contacto de dicha población con una muestra que comprende un anticuerpo policlonal que reconoce específicamente dicho antígeno, uniéndose dicho anticuerpo policlonal a un segundo marcador fluorescente; y d) la separación de la población de aquellas células que se pueden detectar por estar asociadas con el primer y segundo marcadores fluorescentes, en donde la parte b) se lleva a cabo antes de las partes a) y c) , y en donde a la parte b) le sigue una etapa de lavado.

Los términos "células que son capaces de producir un anticuerpo" o "célula que produce anticuerpos" incluyen 65 cualquier célula que segregue un anticuerpo, tal como un linfocito B, una célula plasmática, un plasmablasto, un linfocito B activado, o un linfocito B de memoria. Dichas células pueden producir anticuerpos de cualquier afinidad, por ejemplo, un anticuerpo de alta afinidad o un anticuerpo de baja afinidad. Los métodos de la invención no dependen de la afinidad del anticuerpo producido por dichas células. Una población que comprende células que producen anticuerpos para su utilización en la invención se pueden obtener de un animal que haya sido inmunizado con un antígeno de interés, o que haya desarrollado una respuesta inmunitaria a un antígeno como resultado de una 5 enfermedad. Por ejemplo, y sin limitación, la población puede comprender una muestra de células sanguíneas periféricas, células esplénicas o células derivadas de un nódulo linfático. Otras poblaciones que comprenden células que producen anticuerpos para su utilización en la presente invención pueden incluir una población de células de hibridoma, una población que comprende cualquier célula transformada, y en particular, una población que comprende cualquier célula de mamífero que exprese genes de inmunoglobulinas o una parte de los mismos. Ejemplos de dichas células de mamífero incluyen, pero no están limitadas a, las células NS0, CHO, COS y 293. En una forma de realización preferida, las poblaciones de células que producen anticuerpos para su utilización en la presente invención producen una variedad de anticuerpos con diferentes especificidades de unión. En otra forma de realización, la población de células que comprende al menos una célula que produce un anticuerpo que reconoce un antígeno de interés procede de diversas fuentes, por ejemplo, y sin limitación, de diversos nódulos linfáticos que pueden proceder de uno o más animales. También será evidente que se pueden reunir las muestras o poblaciones de células procedentes de dos o más animales para su utilización en los métodos de la invención. En una forma de realización particular, la población de células procede de un ser humano que ha sido expuesto a un antígeno de interés o que ha desarrollado una respuesta inmunitaria a un antígeno como resultado de una dolencia o enfermedad. En tal caso, la muestra que comprende la población de células para el enriquecimiento es preferentemente una muestra de sangre periférica o de uno o más nódulos linfáticos.

Preferentemente, la población se suspende en un medio apropiado para su utilización en los métodos de la invención. Un medio apropiado para el ensayo será aquel que proporcione al menos los requerimientos mínimos para el mantenimiento a corto plazo de la integridad y de las estructuras celulares, tal como un tampón isotónico. Un ejemplo, sin limitación, es un medio para células inmunitarias que comprende el medio Roswell Park Memorial Institute (RPMI) + suero fetal bovino al 10 %; 2-β-mercaptoetanol 50 μM; glutamina 2 mM; Hepes 20 mM; y penicilina y estreptomicina 1x. En dichas condiciones, las células que producen anticuerpos producen y segregan anticuerpos.

Una población que comprende células que producen anticuerpos se puede despojar de células no deseadas, tales como por ejemplo y sin limitación, glóbulos rojos, linfocitos T, macrófagos u otras células, si así... [Seguir leyendo]

1. Un método de enriquecimiento de una población de células en aquellas células que producen un anticuerpo que reconoce un antígeno de interés, que comprende:

a) la puesta en contacto de dicha población con un anticuerpo que reconoce CD5, CD9, CD10, CD19, CD20, CD21, CD22, CD45 o CD45 RC, uniéndose dicho anticuerpo a un primer marcador fluorescente, b) la puesta en contacto de dicha población con un antígeno de interés que está sin marcar, c) la puesta en contacto de dicha población con una muestra que comprende un anticuerpo policlonal que reconoce específicamente dicho antígeno, uniéndose dicho anticuerpo policlonal a un segundo marcador fluorescente, y d) la separación de la población de aquellas células que se pueden detectar por estar asociadas con el primer y 15 segundo marcadores fluorescentes;

en donde la parte b) se lleva a cabo antes de las partes a) y c) , y en donde a la parte b) le sigue una etapa de lavado.

2. El método de la reivindicación 1, en donde las partes a) y c) se llevan a cabo de manera simultánea y la ejecución comprende opcionalmente al menos una etapa de lavado.

3. El método de la reivindicación 1, en donde las partes a) y c) se llevan a cabo de manera consecutiva o las partes c) y a) se llevan a cabo de manera consecutiva, y en donde cada una de las ejecuciones comprende de manera 25 opcional al menos una etapa de lavado.

4. El método de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, en donde la parte a) comprende de manera adicional la puesta en contacto de dicha población con un anticuerpo que reconoce un segundo biomarcador esencialmente único para aquellas células presentes en la población que son capaces de producir un anticuerpo, siendo marcado dicho anticuerpo con un tercer marcador.

5. El método de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4, en donde la separación de las células que producen un anticuerpo que reconoce el antígeno de interés se lleva a cabo utilizando clasificación celular activada por fluorescencia.

6. Un método según una cualquiera de las reivindicaciones precedentes que comprende adicionalmente:

e) el cultivo de una pluralidad de aquellas células asociadas con el complejo antígeno-anticuerpo-partícula;

f) la selección de las células cultivadas para identificar aquellas células capaces de producir un anticuerpo que reconoce un antígeno de interés; y g) el aislamiento de dicho anticuerpo directa o indirectamente a partir de las células.