Un método de reducir el contenido rico en manosa de glicoproteínas producidas recombinantemente de tal formaque menos de alrededor del 10% de las glicoproteínas en la composición tengan más de 4 residuos de manosa poroligosacárido N-ligado,

comprendiendo cultivar una célula huésped mamífera, que expresa la glicoproteínarecombinante, durante alrededor de 5 a 14 días en un medio de cultivo que tiene una osmolalidad de alrededor de250 mOsm/Kg a alrededor de 600 mOsm/kg, el medio de cultivo comprendiendo betaína a una concentración dealrededor de 20 mM a alrededor de 30 mM, potasio a una concentración de alrededor de 10 mM a alrededor de 70mM , y sodio a una concentración de alrededor de 50 mM a alrededor de 200 mM.

Metodos para modular el contenido de manosa de proteinas recombinantes.

Antecedentes de la Invención

Los eucariotas superiores realizan una variedad de modificaciones post-translacionales, incluyendo metilación, sulfatación, fosforilación, adición de lípidos y glicosilación. Dichas modificaciones pueden ser de importancia crítica para la función de una proteína. Las proteínas secretadas, las proteínas de membrana, y las proteínas dirigidas a vesículas o ciertos orgánulos intracelulares es proba le que sean glicosiladas.

La glicosilación N-ligada es una forma de glicosilación que implica la adición de oligosacáridos a un residuo de asparagina encontrado en secuencias de reconocimiento (por ejemplo, Asn-X-Ser/Thr) en proteínas. Las glicoproteínas N-ligadas contiene estructuras ramificadas estándares, que están compuestas de manosa (Man) , galactosa, N-acetilglucosamina (GlcNac) , y ácidos neurámicos. La N-glicosilación de la proteína típicamente se origina en el retículo endoplásmico (ER) , donde un oligosacárido N-ligado (por ejemplo Clc3 Man9 GlcNAc2) montado en dolicol (un intermediario portador lípido) se transfiere a la Asparagina (Asn) apropiada de una proteína naciente. Este es un suceso común a todas las glicoproteínas N-ligadas eucariotas. Hay dos tipos principales de sacáridos Nligados: oligosacáridos ricos en manosa, y oligosacáridos complejos.

Los oligosacáridos ricos en manosa típicamente incluyen dos N-acetilglucosaminas con muchos residuos de manosa (por ejemplo, más d e4) . Los oligosacáridos complejos se llaman así porque pueden contener casi cualquier número de los otros tipos de sacáridos, incluyendo más de las dos N-acetilglucosaminas originales. Las proteínas pueden ser glicosiladas por ambos tipos de oligosacáridos en diferentes partes de la proteína. Si un oligosacárido es rico en manosa o complejo se cree que depende de su accesibilidad a las proteínas que modifican los sacáridos en el aparato Golgi. Si el sacárido es relativamente inaccesible, permanecerá más probablemente en su forma rica en manosa original. Si es accesible, entonces es probable que muchos de los residuos de manosa sean escindidos y el sacárido será además modificado por la adición de otros tipos de grupos como se ha mencionado anteriormente.

Después de que una cadena de oligosacáridos se ha añadido a una proteína, los tres residuos de glucosa y uno de manosa se retiran por tres enzimas diferentes en un orden fijado. Este suceso ocurre en el ER y es una señal de que la proteína puede ser transportada a un Golgi para procesamiento adicional. Después del procesamiento en el ER, se forma el oligosacárido del tipo rico en manosa. Los tres residuos de glucosa y un residuo de manosa alfa1, 2 ligado específico son retirados por glucosidasas específicas y una alfa-1, 2-manosidasa en el ER, resultando en la estructura del oligosacárido central, Man8 GlcNac2. La proteína con su estructura de azúcar central se transporta al aparato Golgi donde la porción de azúcar experimenta varias modificaciones.

En las células mamíferas, la modificación de la cadena de azúcar procede por 3 sistemas diferentes dependiendo de la porción de proteína a la que se añade. Los tres sistemas diferentes son: (1) la cadena de azúcar central no cambia; (2) la cadena de azúcar central se cambia añadiendo la porción N-acetilglucosamina-1-fosfato (GlcNAc-1-P) en UDP-N-acetilglucosamina (UDP-GlcNAc) a la posición 6 de la manosa en la cadena de azúcar central, seguido por la retirada de la porción GlcNac para formar una cadena de azúcar ácida en la glicoproteína; o

(3) la cadena de azúcar central se convierte primero en Man5 GlcNAc2 retirando 3 residuos de manosa con manosidasa I; la Man5 GlcNAc2 se modifica adicionalmente añadiendo GlcNAc y retirando 2 residuos de manosa más, seguido por la adición secuencialmente de GlcNAc, galactosa (Gal) , y ácido N-acetilneuramínico (también llamado ácido siálico (neuNAc) ) para formar varias cadenas de azúcar híbridas o complejas (R. Kornfeld y S. Kornfeld, Ann. Rev. Biochem. 54: 631-664 (1985) ; Chib ay otros, J. Biol. Chem. 273: 26298-26304 (1998) ) .

El contenido de oligosacáridos de las proteínas recombinantes puede afectar a la seguridad y eficacia de las glicoproteínas terapéuticas. En consecuencia, los métodos para controlar el contenido de oligosacáridos, particularmente el contenido de manosa, de dichas glicoproteínas sería beneficioso.

H. Li y otros (Nature Biotechnology 24:210-215 (2006) ) describen que los anticuerpos humanos con estructuras de N-glicanos humanas se pueden producir en líneas glicodiseñadas de Pichia pastoris. L. Zhu y otros (Nature Biotechnology; 23: 1159-1169 (2005) ) describen un método para la producción de anticuerpos monoclonales que tienen glicosilación no antigénica en huevos de pollos quiméricos.

En la WO 02/00879 A, se describen métodos para la producción de glicoproteínas modificadas en líneas celulares que tienen sistemas de glicosilación genéticamente modificados, que imitan el procesamiento de glicoproteínas en humanos.

El contenido rico en manosa de composiciones de glicoproteínas, particularmente anticuerpos terapéuticos, puede afectar significativamente a la seguridad y eficacia de dichas proteínas durante el uso terapéutico. Sin estar atados a una teoría particular, la evidencia sugiere que las glicoproteínas ricas en manosa son eliminadas de la circulación más rápido que sus equivalentes de manosa baja debido a, por ejemplo, los receptores de manosa en los

macrófagos y las células dendríticas. Adicionalmente, las glicoproteínas ricas en manosa se espera que sean más inmunogénicas. En consecuencia, es deseable producir glicoproteínas terapéuticas como, por ejemplo, anticuerpos terapéuticos, que tienen un contenido de manosa bajo.

Los presente inventores resuelven esta necesidad en la técnica proporcionando métodos para modular (por ejemplo, controlar o reducir) el contenido de manosa de proteínas y péptidos producidos recombinantemente.

Resumen de la invención

La presente invención se basa, al menos en parte, en el descubrimiento de factores que afectan al contenido de manosa y, en particular, al contenido de manosa alto, de glicoproteínas expresadas recombinantemente. La invención puede ser definida por las reivindicaciones añadidas.

Por lo tanto, en una realización, se proporciona un método de reducir el contenido de manosa alto de glicoproteínas producidas recombinantemente de tal forma que menos de alrededor del 10% de las glicoproteínas en la composición tienen más de 4 residuos de manosa por oligosacárido N-ligado. El método comprende cultivar una célula huésped mamífera que expresa la proteína recombinante durante alrededor de 5 a 14 días en un medio de cultivo que tienen una osmolalidad de alrededor de 250 mOsm/Kg a alrededor de 600 mOsm/Kg, el medio de cultivo comprendiendo betaína a una concentración de alrededor de 20 mM a alrededor de 30 mM, potasio a una concentración de alrededor de 10mM a alrededor de 70 mM, y sodio a una concentración de alrededor de 50 mM a alrededor de 200 mM.

Por consiguiente, en un aspecto, la presente invención proporciona un método de reducir el contenido de manosa (es decir, en una cadena lateral de oligosacárido) de una glicoproteína recombinante producida en una célula huésped mamífera manipulando las condiciones del cultivo celular de tal forma que la glicoproteína producida por la célula tenga contenido de manosa bajo. Como se usa en la presente, el término "contenido de manosa bajo" se refiere a composiciones de glicoproteínas en donde menos de alrededor del 10%, o menos de alrededor del 8%,

o menos de alrededor del 5% (por ejemplo, alrededor del 4% o menos) de las glicoproteínas en la composición tengan más de 4 residuos de manosa (es decir, son especies de la M5 o mayor) . Como se usa en la presente, el término "contenido de manosa bajo" también se refiere a composiciones de glicoproteínas en donde menos de alrededor del 10%, menos de alrededor del 9%, menos de alrededor del 8%, menos de alrededor del 7%, menos de alrededor del 6%, menos de alrededor del 5%, menos de alrededor del 4%, menos de alrededor del 3%, menos de alrededor del 2%, menos de alrededor del 1%, o cualquier valor entre cualquiera de estos intervalos precedentes, incluso cero.

El contenido de manosa bajo puede ser conseguido manteniendo el entorno del cultivo celular a osmolalidad... [Seguir leyendo]

1. Un método de reducir el contenido rico en manosa de glicoproteínas producidas recombinantemente de tal forma que menos de alrededor del 10% de las glicoproteínas en la composición tengan más de 4 residuos de manosa por oligosacárido N-ligado, comprendiendo cultivar una célula huésped mamífera, que expresa la glicoproteína recombinante, durante alrededor de 5 a 14 días en un medio de cultivo que tiene una osmolalidad de alrededor de 250 mOsm/Kg a alrededor de 600 mOsm/kg, el medio de cultivo comprendiendo betaína a una concentración de alrededor de 20 mM a alrededor de 30 mM, potasio a una concentración de alrededor de 10 mM a alrededor de 70 mM , y sodio a una concentración de alrededor de 50 mM a alrededor de 200 mM.

2. Un método de reducir el contenido rico en manosa de anticuerpos producidos recombinantemente, o un fragmento que enlaza con el antígeno de los mismos, de tal forma que menos de alrededor del 10% de las glicoproteínas en la composición tengan más de 4 residuos de manosa por oligosacárido N-ligado, comprendiendo cultivar una célula huésped mamífera, que expresa el anticuerpo recombinante o el fragmento que enlaza con el antígeno del mismo, días en un medio de cultivo que tiene una osmolalidad de alrededor de 250 mOsm/Kg a alrededor de 600 mOsm/kg, el medio de cultivo comprendiendo betaína a una concentración de alrededor de 20 mM a alrededor de 30 mM, potasio a una concentración de alrededor de 10 mM a alrededor de 70 mM , y sodio a una concentración de alrededor de 50 mM a alrededor de 200 mM.

3. El método de la reivindicación 2 para reducir el contenido rico de manosa de anticuerpos monoclonales humanos recombinantes, o el fragmento que enlaza con el antígeno de los mismos, que enlaza con el IL-15, en donde el anticuerpo o el fragmento que enlaza con el antígeno del mismo comprende una región variable de cadena ligera que comprende al secuencia de aminoácido expresada en la SEQ ID NO:4, o sustituciones de aminoácido conservadoras de la misma, y una región variable de cadena pesada que comprende la secuencia de aminoácido expresada en la SEQ ID NO:2, o sustituciones de aminoácido conservadora de la misma.

4. El método de cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, en donde la osmolalidad del medio de cultivo está entre alrededor de 250 y alrededor de 500 mOsm/KG, o entre alrededor de 250 y alrededor de 380 mOsm/Kg.

5. El método de las reivindicaciones 1 a 3, en donde el medio de cultivo está sustancialmente libre de uno o más aminoácidos seleccionados del grupo consistente de alanina, arginina, ácido aspártico y ácido glutámico.

6. El método de las reivindicaciones 1 a 3, en donde el medio de cultivo comprende una o más vitaminas seleccionadas del grupo consistente de biotina, pantotenato de calcio-D, cloruro de colina, ácido fólico, i-inositol, niacinamida, HCl piridoxal, HCl piridoxina, riboflavina, HCl tiamina, cianocobalamina a una concentración de alrededor de 0, 00005 g/L a alrededor de 0, 9 g/L.

7. El método de las reivindicaciones 1 a 3, en donde el medio de cultivo comprende glucosa a una concentración de alrededor de 1 mM a alrededor de 90 mM.

8. El método de las reivindicaciones 1 a 3, en donde el medio de cultivo comprende una o más peptonas seleccionadas del grupo consistente de extracto de levadura, hidrolizado de levadura, peptona de soja, hidrolizado de soja, peptona de trigo e hidrolizado de trigo, a una concentración de alrededor de 0, 5 g/L a alrededor de 60 g/L.

9. El método de las reivindicaciones 1 a 3, en donde el medio de cultivo comprende al menos dos osmoprotectores en una cantidad necesaria para mantener la osmolalidad en de alrededor de 250 mOsm/KG a alrededor de 600 mOsm/Kg.

10. El método de la reivindicación 9, en donde uno de los mencionados osmoprotectores es seleccionado del grupo consistente de glicina, L-treonina, L-prolina, y derivados de los mismos.

11. El método de cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, en donde la célula huésped es una célula CHO.