Un método in vitro exento de células de remodelación de un péptido G-CSF que comprende polietilenglicol (PEG),

teniendo dicho péptido la fórmula: }-AA-(X 1 )u en la que AA es un residuo aminoacídico terminal o interno de dicho péptido; X 1 es un residuo monosacárido ligado covalentemente con dicho AA; y u es un entero seleccionado de 0 y 1; comprendiendo dicho método poner en contacto dicho péptido con al menos una glicosiltransferasa y al menos un donante de glicosilo que comprende polietilenglicol que tiene un peso molecular de 20 kDa ligado covalentemente con el mismo, en condiciones adecuadas para transferir dicho al menos un donante de glicosilo a dicho péptido

Métodos de glicopegilación y proteínas/péptidos producidos por los métodos

Antecedentes de la invención

La mayoría de péptidos de origen natural contienen restos de carbohidrato unidos al péptido mediante ligadores específicos con un número seleccionado de aminoácidos a lo largo de toda la cadena peptídica primaria. Por tanto, muchos péptidos de origen natural se denominan “glicopéptidos”. La variabilidad del patrón de glicosilación en cualquier péptido dado tiene enormes implicaciones para la función de ese péptido. Por ejemplo, la estructura de los glicanos Nligados en un péptido puede influir en diversas características del péptido, incluyendo susceptibilidad a proteasa, tráfico intracelular, secreción, orientación a tejido, semivida biológica y antigenicidad del péptido en una célula u organismo. La alteración de una o más de estas características afecta en gran medida a la eficacia de un péptido en su entorno natural, y afecta también a la eficacia del péptido como agente terapéutico en situaciones en que el péptido se ha generado con ese fin.

La estructura del carbohidrato unido a la cadena peptídica es conocida como una molécula de “glicano”. La estructura de glicano específica presente en un péptido afecta a las características de solubilidad y agregación del péptido, al plegamiento de la cadena peptídica primaria y por lo tanto a su actividad funcional o enzimática, a la resistencia del péptido al ataque proteolítico y al control de la proteólisis que conduce a la conversión de formas inactivas del péptido en formas activas. De forma importante, los residuos de ácido siálico presentes en la molécula de glicano afectan a la duración de la semivida del péptido en el sistema circulatorio de mamíferos. Los péptidos cuyos glicanos no contienen residuos de ácido siálico terminales se eliminan rápidamente de la circulación por el hígado, un evento que anula cualquier beneficio terapéutico potencial del péptido.

Las estructuras de glicano encontradas en glicopéptidos de origen natural se dividen típicamente en dos clases, glicanos N-ligados y O-ligados.

Los péptidos expresados en células eucarióticas están típicamente N-glicosilados en los residuos de asparagina en sitios de la estructura primaria peptídica que contienen la secuencia asparagina-X-serina/treonina, en que X puede ser cualquier aminoácido excepto prolina y ácido aspártico. La porción de carbohidrato de dichos péptidos es conocida como un glicano N-ligado. Los eventos tempranos de N-glicosilación ocurren en el retículo endoplasmático (RE) y son idénticos en mamíferos, plantas, insectos y otros eucariotas superiores. En primer lugar, se construye una cadena oligosacárida que comprende 14 residuos de azúcar en una molécula portadora lipídica. A medida que el péptido naciente se traduce y traslada al RE, se transfiere toda la cadena oligosacárida al grupo amida del residuo de asparagina en una reacción catalizada por una enzima glicosiltransferasa unida a membrana. El glicano N-ligado se procesa adicionalmente tanto en el RE como en el aparato de Golgi. El procesamiento adicional conlleva generalmente la eliminación de algunos de los residuos de azúcar y la adición de otros residuos de azúcar en reacciones catalizadas por glicosidasas y glicosiltransferasas específicas de los residuos de azúcar eliminados y añadidos.

Típicamente, las estructuras finales de los glicanos N-ligados dependen del organismo en que se produce el péptido. Por ejemplo, en general, los péptidos producidos en bacterias están completamente no glicosilados. Los péptidos expresados en células de insecto contienen cadenas oligosacáridas N-ligadas ricas en manosa y paucimanosa, entre otras. Los péptidos producidos en cultivo de células de mamífero se glicosilan habitualmente de forma diferente dependiendo, por ejemplo, de la especie y de las condiciones del cultivo celular. Incluso en la misma especie y en las mismas condiciones, se encuentra a veces una cierta cantidad de heterogeneidad en las cadenas de glicosilo. Además, los péptidos producidos en células de planta comprenden estructuras de glicano que difieren significativamente de los producidos en células animales. El problema en la materia de la producción de péptidos recombinantes, particularmente cuando los péptidos se van a usar como agentes terapéuticos, es poder generar péptidos que estén correctamente glicosilados, concretamente, poder generar un péptido que tenga una estructura de glicano que se parezca, o sea idéntica, a la presente en la forma de origen natural del péptido. La mayoría de péptidos producidos por medios recombinantes comprenden estructuras de glicano que son diferentes de los glicanos de origen natural.

Se ha propuesto una variedad de métodos en la materia para personalizar el patrón de glicosilación de un péptido, incluyendo aquellos descritos en los documentos WO 99/22764, WO 98/58964, WO 99/54342 y la patente de EE.UU. nº 5.047.335, entre otros. Esencialmente, se han clonado y secuenciado muchas de las enzimas necesarias para la glicosilación in vitro de péptidos. En algunos casos, se han usado estas enzimas in vitro para añadir azúcares específicos a una molécula de glicano incompleta en un péptido. En otros casos, se han modificado por ingeniería genética células para expresar una combinación de enzimas y péptidos deseados de tal modo que ocurra en la célula la adición de un resto de azúcar deseado a un péptido expresado.

Los péptidos pueden modificarse también mediante la adición de glicanos N-ligados, también llamados glicanos de tipo mucina debido a su prevalencia en glicopéptidos mucinosos. Al contrario que los N-glicanos, que están ligados con residuos de asparagina y se forman por una transferencia en bloque de oligosacárido desde los intermedios unidos a lípido, los O-glicanos están ligados principalmente con residuos de serina y treonina y se forman mediante la adición por etapas de azúcares desde azúcares-nucleótidos (Tanner et al., Biochim. Biophys. Acta. 906: 81-91 (1987) y Hounsell et al., Glycoconj. J. 13:19-26 (1996) ) . La función peptídica puede verse afectada por la estructura de los glicanos O-ligados presentes en el mismo. Por ejemplo, la actividad del ligando de P-selectina se ve afectada por la estructura de glicano O-ligado presente en el mismo. Para una revisión de las estructuras de glicano O-ligado, véase Schachter y Brockhausen, “The Biosynthesis of Branched O-Linked Glycans”, 1989, Society for Experimental Biology, pág. 1-26 (Gran Bretaña) . Se forman otros patrones de glicosilación ligando glicosilfosfatidilinositol con el grupo carboxilo carboxiterminal de la proteína (Takeda et al., Trends Biochem. Sci. 20: 367-371 (1995) y Udenfriend et al., Ann. Rev. Biochem. 64:593-591 (1995) .

Aunque existen actualmente diversas técnicas para modificar los glicanos N-ligados de péptidos, existe la necesidad en la materia de un método aplicable genéricamente de producción de péptidos que tengan un patrón de glicosilación deseado, concretamente personalizado. Hay una necesidad particular en la materia de una glicosilación in vitro personalizada de péptidos en que el péptido resultante pueda producirse a escala industrial. Esta y otras necesidades se satisfacen por la presente invención.

La administración de péptidos glicosilados y no glicosilados para generar una respuesta fisiológica particular es bien conocida en las técnicas médicas. Entre los péptidos mejor conocidos utilizados con este fin está la insulina, que se usa para tratar la diabetes. Las enzimas se han usado también por sus beneficios terapéuticos. Un factor importante que ha limitado el uso de péptidos terapéuticos es la naturaleza inmunogénica de la mayoría de los péptidos. En un paciente, una respuesta inmunogénica a un péptido administrado puede neutralizar el péptido y/o conducir al desarrollo de una respuesta alérgica en el paciente. Otras deficiencias de los péptidos terapéuticos incluyen una potencia subóptima y las rápidas velocidades de aclaramiento. Los problemas inherentes a la terapia peptídica están reconocidos en la materia, y se han investigado diversos métodos para eliminar los problemas. Para proporcionar una terapia de péptido soluble, se han unido polímeros sintéticos a la cadena principal peptídica.

El polietilenglicol (“PEG”) es un polímero ejemplar que se ha conjugado con péptidos: el uso de PEG para derivatizar productos terapéuticos peptídicos se ha demostrado que reduce la inmunogenicidad de los péptidos y prolonga el tiempo de aclaramiento... [Seguir leyendo]

1. Un método in vitro exento de células de remodelación de un péptido G-CSF que comprende polietilenglicol (PEG) , teniendo dicho péptido la fórmula:

}-AA- (X1) u en la que AA es un residuo aminoacídico terminal o interno de dicho péptido; X1 es un residuo monosacárido ligado covalentemente con dicho AA; y u es un entero seleccionado de 0 y 1; comprendiendo dicho método poner en contacto dicho péptido con al menos una glicosiltransferasa y al menos un donante de glicosilo que comprende polietilenglicol que tiene un peso molecular de 20 kDa ligado covalentemente con el mismo, en condiciones adecuadas para transferir dicho al menos un donante de glicosilo a dicho péptido.

2. El método de la reivindicación 1, en el que AA es un aminoácido que contiene un grupo hidroxilo libre.

3. El método de la reivindicación 1 o 2, en el que AA es un aminoácido seleccionado de serina, treonina e hidroxiprolina.

4. El método de cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, en el que AA es un residuo de treonina correspondiente a la Thr133 de G-CSF humano.

5. El método de cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4, en el que el donante de glicosilo es ácido siálicopolietilenglicol.

6. El método de cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5, en el que el residuo de monosacarilo es GalNAc.

7. El método de cualquiera de las reivindicaciones 1 a 6, en el que u es 1.

8. El método de cualquiera de las reivindicaciones 1 a 7, en el que el péptido G-CSF se obtiene mediante la expresión de E. coli.

9. Uso de un CMP-ácido siálico-polietilenglicol para formar un conjugado covalente entre un péptido G-CSF y polietilenglicol que tiene un peso molecular de 20 kDa.

10. Un conjugado covalente entre un péptido G-CSF y polietilenglicol que tiene un peso molecular de 20 kDa mediante un grupo ligante de glicosilo que comprende GalNAc y ácido siálico, en el que el conjugado tiene la estructura G-CSF-GalNAc-ácido siálico-polietilenglicol, el péptido G-CSF se obtiene mediante la expresión de E. coli y el grupo ligante de glicosilo se une al péptido G-CSF en un residuo de treonina correspondiente a la Thr133 del G-CSF humano.

11. Un conjugado covalente entre un péptido G-CSF y polietilenglicol que tiene un peso molecular de 20 kDa mediante un grupo ligante de glicosilo que comprende GalNAc y ácido siálico, en el que el conjugado tiene la estructura

a y b se seleccionan independientemente de 0 o 1, el péptido G-CSF se obtiene mediante la expresión de células de CHO y el grupo ligante de glicosilo se une al péptido G-CSF en un residuo de treonina correspondiente a la treonina 133 del G-CSF humano.

12. Composición farmacéutica que comprende un diluyente farmacéuticamente aceptable y un conjugado covalente según la reivindicación 10 u 11.

13. El conjugado covalente de la reivindicación 10 u 11 o la composición farmacéutica de la reivindicación 12 para uso en el tratamiento de un paciente humano que padece un cáncer no mieloide y que recibe quimioterapia mielosupresora, o que tiene leucemia mieloide aguda y recibe quimioterapia de inducción o consolidación, o que padece un cáncer no mieloide y recibe un transplante de médula ósea, o que experimenta la recogida de células progenitoras de sangre periférica o que tiene una neutropenia crónica grave o que tiene neutropenia persistente y también que tiene una infección por VIH avanzada.

Folistatina- Biotech Australia, Human Therapeutics Glutamato descarboxilasa- Genzyme Transgenics Folitropina alfa, Alkermes, ProLease, PowderJect, Glicoproteína S3- Kureha Serono, Akzo Nobel Folitropina beta, Bayer, Organon GM-CSF, Immunex FP59 Vacuna tumoral de GM-CSF, PowderJect FSH- Ferring GnRH inmunoterapéutica- Protherics FSH + LH- Ferring Goserelina (antagonista de LHRH) - AstraZeneca F-espondina- CeNeS Antígeno de gp75- ImClone Sistema de suministro de proteína de fusión- UAB gp96- Antigenics Research Foundation Toxinas de fusión- Boston Life Sciences GPI 0100- Galenica G 5598- Genentech GR 4991W93- GlaxoSmithKline GA-II- Transkar y otic Therapies Factor estimulante de colonias de granulocitos- Dong-A

Análogos de interferón gamma- SRC VB VECTOR Conjugado de factor estimulante de colonias de granulocitosterapia de alergia a la hierba-Dynavax

Ganirelix- Roche GRF1-44- ICN

Lipasa gástrica- Meristem Factor de crecimiento- Chiron, Atrigel, Atrix, Innogenetics, ZymoGenetics, Novo Gavilimomab- Péptidos de factor de crecimiento- Biotherapeutics G-CSF- Amgen, SRC VB VECTOR Hormona de crecimiento, LG

GDF-1- CeNeS Hormona de crecimiento humana recombinante- Serono GDF-5- Biopharm GT 4086- Gliatech

GDNF (factor neurotrófico derivado de glía) - Amgen GW-353430-GlaxoSmithKline Gelsolina- Biogen GW-278884- GlaxoSmithKline Gemtuzumab ozogamicina- Celltech H 11- Viventia Biotech Epoetina alfa activada génicamente- Aventis Pharma-Vacuna del virus de la gripe A H5N1- Protein Sciences Transkar y otic Therapies Terapia génica de trombasterina de Glanzmann- Hemoglobina- Biopure Acetato de glatiramer- Yeda Hemoglobina 3011 recombinante- Baxter Healthcare Factor de crecimiento glial 2- CeNeS Crosfumarilo de hemoglobina- Baxter Intl.

GLP-1- Amylin, Suntor y , TheraTech Watson Hemoglobina estabilizada- Ajinomoto Glucagón- Eli Lilly, ZymoGenetics Hemoglobina recombinante- Apex

Péptido 17-36-amida de tipo glucagón- Suntor y HAF- Immune response Péptido de tipo glucagón- Amylin Vacuna de hantavirus Glucocerebrosidasa- Genzyme HB 19 HBNF- Regeneron HCC-1- Pharis hCG- Milkhaus a-c, e (independientemente seleccionados) = 0 o 1; d= 0; R= grupo modificador, sialilo u oligosialilo