Clon de células que producen FSH.

Molécula de ácido nucleico que comprende una secuencia de ácido nucleico que codifica la cadena β

hormona estimulante del folículo (FSH) humana, que es la región codificadora de la secuencia de ácido nucleicosegún SEQ ID NO: 1.

Clon de células que producen FSH

La presente invención se refiere a moléculas de ácido nucleico que comprenden una secuencia de ácido nucleico que codifica la cadena º de la hormona estimulante del folículo (FSH) humana, en donde la secuencia de ácido nucleico se ha modificado en células CHO con respecto al uso de codones, en comparación con la secuencia de ácido nucleico de FSH humana de tipo silvestre.

La presente invención se refiere además a una molécula de ácido nucleico recombinante que comprende tales secuencias de ácido nucleico y a células hospedadoras que contienen tales moléculas de ácido nucleico recombinante, así como a su uso en la producción de FSH humana recombinante.

Por último, la presente invención también se refiere a un método para producir células hospedadoras que expresan la hormona estimulante del folículo humana mediante la transfección de células cultivadas en suspensión en condiciones exentas de suero, con la molécula de ácido nucleico recombinante de la presente invención.

La hormona estimulante del folículo (FSH) es producida por las células gonadotrópicas de la pituitaria anterior y se libera en la circulación. La FSH actúa junto con la hormona luteinizante (LH) sobre el control de la maduración de oocitos en las hembras y de la espermatogénesis en los machos. Tanto la FSH como la LH pertenecen a una familia de glicoproteínas heterodímeras que consisten en dos cadenas a y º unidas no covalentemente, que están codificadas por genes distintos. Mientras que la secuencia de aminoácidos de la cadena a de FSH y LH es idéntica, la secuencia de aminoácidos de la cadena º es diferente en ambas proteínas. Tanto la cadena a como la º están glicosiladas. La cadena a de la FSH tiene dos sitios potenciales de glicosilación ligados a asparagina en las posiciones 52 y 78, mientras que la cadena º de la FSH tiene dos sitios potenciales de glicosilación ligados a asparagina en las posiciones 7 y 24 (Olijve et al. (1996) Mol. Hum. Reprod. 2 (5) : 371-382) .

La FSH humana se utiliza para tratar a mujeres con anovulación, para estimular el desarrollo multifolicular (superovulación) y en la preparación de una reproducción asistida como IVF, GIFT o ZIFT. Por otra parte, la FSH humana se utiliza para estimular la maduración de los folículos en mujeres con una producción baja o inexistente de FSH y para estimular la espermatogénesis en hombres con hipogonadismo hipogonadotrópico congénito o adquirido.

Originalmente, la FSH para usos medicinales se purificaba a partir de orina humana post-menopáusica. Sin embargo, esta FSH purificada tiene el inconveniente de que también contiene LH y otras proteínas contaminantes de origen humano. Por otra parte, el uso de una fuente natural de este tipo, implica una disponibilidad y consistencia limitadas del producto.

Con la llegada de la tecnología del ADN recombinante, se hizo posible producir FSH humana en cultivos de células transfectadas con secuencias de ácido nucleico que codificaban la cadena a y º. Las secuencias de ADN que codifican las cadenas a y º y los métodos para producir FSH humana recombinante, se han descrito, por ejemplo, en los documentos WO 88/10270, WO 86/04589 y EP 0 735 139.

Actualmente, hay dos productos comerciales de FSH humana recombinante en el mercado en Alemania, a saber, GONAL-F® y PUREGON®, produciéndose ambos mediante la expresión del ADN de tipo silvestre que codifica las cadenas a y º en células CHO.

Sin embargo, todavía existe una necesidad de mejorar la expresión de las cadenas de FSH para perfeccionar el rendimiento y la tasa de expresión de la FSH en un número dado de células. Por tanto, un problema subyacente de la presente invención es proporcionar secuencias de ácido nucleico y moléculas de ácido nucleico recombinante a través de las cuales se pueda producir FSH humana recombinante en grandes cantidades en células eucariotas.

El documento WO 01/58493 A1 describe plásmidos que contienen genes que codifican la cadena a y la º de FSH, en donde los genes estaban adaptados para el uso de codones en células de mamífero.

Wang et al. (2006) Chinese Journal of Experimental and Clinical Virology 20 (3) : 266-269 describen que el uso de codones en células CHO negativas para dhfr difiere del uso de codones en hámster chino.

Gustafsson et al. (2004) Trends in Biotechnology 22 (7) : 346-353 analizan que la preferencia de codones de un organismo hospedador puede influir sobre el nivel de expresión de las proteínas heterólogas.

El documento WO 2007/003640 A1 describe un método para cultivar células que expresan FSH en un medio exento de suero que contiene antioxidantes tales como glutatión, 2-mercaptoetanol, metionina o una combinación de ácido ascórbico y alfa-tocoferol.

De acuerdo con la presente invención, este y otros problemas se resuelven por medio de las características de la reivindicación principal.

Las realizaciones ventajosas se definen en las reivindicaciones dependientes.

De acuerdo con la presente invención, las moléculas de ácido nucleico que comprenden secuencias de ácido nucleico modificadas que codifican la cadena a y la cadena º de la FSH humana, que se han adaptado para el uso de codones en células de ovario de hámster chino (CHO) , se utilizan para la transfección de células CHO y producen un aumento significativo en la producción de FSH en las células CHO transfectadas.

En el contexto de la presente invención, la expresión "aumento de la producción de FSH" se refiere a la situación en la que al concluir la expresión de las secuencias de ácido nucleico modificadas en la célula hospedadora, se produce una mayor cantidad de FSH en una célula hospedadora en comparación con la situación en la que una secuencia de ácido nucleico no modificada que codifica FSH con la misma secuencia de aminoácidos, se expresa en el mismo tipo de células hospedadoras en condiciones similares, tales como por ejemplo, procedimientos de transfección comparables, vectores de expresión comparables, etc.

El código genético es redundante ya que 20 aminoácidos están especificados por 61 codones de tripletes. Por lo tanto, la mayor parte de los 20 aminoácidos proteinógenos están codificados por varios tripletes de bases (codones) . Sin embargo, los codones que especifican un aminoácido particular no se utilizan con la misma frecuencia en un organismo específico, sino que son los codones preferidos los que se utilizan frecuentemente, y los codones raros los que se utilizan con menos frecuencia. Dichas diferencias en el uso de codones se someten a presiones evolutivas selectivas y, en particular, a la eficacia de la traducción. Una de las razones de la baja eficacia de la traducción de los codones que están presentes pocas veces, podría ser que los grupos correspondientes de aminoacil-ARNt se agotan y, por lo tanto, ya no están disponibles para la síntesis de proteínas.

Por otra parte, diferentes organismos prefieren diferentes codones. Así, por ejemplo, la expresión de un ADN recombinante procedente de una célula de mamífero se lleva a cabo frecuentemente de forma imperfecta en células de E. coli. Por lo tanto, la sustitución de codones utilizados pocas veces por codones utilizados con frecuencia puede mejorar la expresión en algunos casos.

De muchos organismos se conoce la secuencia de ADN de un amplio número de genes y existen tablas a partir de las cuales se puede obtener la frecuencia del uso de codones específicos en el organismo respectivo. Mediante el uso de dichas tablas, las secuencias de proteínas se pueden traducir de forma inversa de manera relativamente exacta, para formar una secuencia de ADN que contiene los codones preferidos en el organismo respectivo, para los diferentes aminoácidos de la proteína. Las tablas para el uso de codones se pueden encontrar, entre otras, en las siguientes direcciones de Internet:

http://www.kazusa.or.jp/codon/index.html o

http://www.entelechon.com/index.php?id=tools/index.

También hay programas disponibles para la traducción inversa de una secuencia de proteína, por ejemplo, la secuencia proteica de la cadena a o de la cadena º de la FSH humana, para formar una secuencia de ADN degenerado, como por ejemplo en http://www.entelechon.com/eng/backtranslation.html.

La expresión "secuencia de ácido nucleico" para los fines de la presente invención, se refiere a cualquier molécula de ácido nucleico que codifica polipéptidos, tales como péptidos, proteínas, etc. Estas moléculas de ácido nucleico pueden ser de ADN, de ARN o de análogos de los mismos. Sin embargo, se prefieren las moléculas de ácido nucleico preparadas con ADN.

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1. Molécula de ácido nucleico que comprende una secuencia de ácido nucleico que codifica la cadena de la hormona estimulante del folículo (FSH) humana, que es la región codificadora de la secuencia de ácido nucleico según SEQ ID NO: 1.

2. Molécula de ácido nucleico recombinante que comprende una primera secuencia de ácido nucleico según la reivindicación 1, bajo el control de un promotor que es activo en una célula hospedadora.

3. Molécula de ácido nucleico recombinante según la reivindicación 2, que comprende adicionalmente una segunda secuencia de ácido nucleico que codifica la cadena a de la hormona estimuladora del folículo (FSH) humana que se selecciona a partir del grupo que consiste en la región codificadora de la secuencia de ácido nucleico según SEQ ID NO: 2 y secuencias de ácido nucleico que tienen una identidad de secuencia de al menos el 85% con la región codificadora de la secuencia de ácido nucleico tal y como se describe en SEQ ID NO: 2.

4. Molécula de ácido nucleico recombinante según la reivindicación 2, que comprende adicionalmente una segunda secuencia de ácido nucleico que se selecciona a partir del grupo que consiste en la región codificadora de la secuencia de ácido nucleico según SEQ ID NO: 3 y secuencias de ácido nucleico que tienen una identidad de secuencia de al menos el 70% con la región codificadora de la secuencia de ácido nucleico tal y como se describe en SEQ ID NO: 3.

5. Molécula de ácido nucleico recombinante según la reivindicación 3 o 4, en la que la segunda secuencia de ácido nucleico está bajo el control de un promotor distinto.

6. Molécula de ácido nucleico recombinante según cualquiera de las reivindicaciones 2 a 5, en la que la primera secuencia de ácido nucleico y/o la segunda secuencia de ácido nucleico está bajo el control de un promotor vírico.

7. Molécula de ácido nucleico recombinante según la reivindicación 6, en la que la primera secuencia de ácido nucleico está bajo el control de un promotor de SV40.

8. Molécula de ácido nucleico recombinante según la reivindicación 6, en la que la segunda secuencia de ácido nucleico está bajo el control de un promotor de CMV.

9. Molécula de ácido nucleico recombinante según cualquiera de las reivindicaciones 2 a 8, que tiene la secuencia de ácido nucleico tal y como se describe en SEQ ID NO: 7.

10. Célula hospedadora que contiene una molécula de ácido nucleico recombinante según cualquiera de las reivindicaciones 3 a 9.

11. Célula hospedadora según la reivindicación 10, que es una célula de mamífero.

12. Célula hospedadora según la reivindicación 10 o 11, que es una célula de ovario de hámster chino (CHO) .

13. Célula hospedadora según cualquiera de las reivindicaciones 10 a 12, que tiene el número de depósito DSM ACC2833.

14. Célula hospedadora que contiene una primera molécula de ácido nucleico recombinante según la reivindicación 2, y una segunda molécula de ácido nucleico recombinante que comprende una secuencia de ácido nucleico que codifica la cadena a de la hormona estimuladora del folículo (FSH) humana que se selecciona a partir del grupo que consiste en la región codificadora de la secuencia de ácido nucleico según SEQ ID NO: 2, teniendo las secuencias de ácido nucleico una identidad de secuencia de al menos el 85% con la región codificadora de la secuencia de ácido nucleico tal y como se describe en SEQ ID NO: 2 y la secuencia de ácido nucleico tal y como se describe en SEQ ID NO: 3.

15. Cultivo celular que comprende la célula hospedadora según cualquiera de las reivindicaciones 10 a 14, en un medio de cultivo adecuado.

16. Método para la producción de FSH humana recombinante, que comprende las etapas de:

- cultivar una célula hospedadora según cualquiera de las reivindicaciones 10 a 14, en un medio de cultivo adecuado; y

- recoger el material sobrenadante del cultivo celular.

17. Método según la reivindicación 16, que comprende adicionalmente la etapa de purificación de la FSH humana recombinante a partir del material sobrenadante del cultivo c.

18. Método para producir la célula hospedadora según cualquiera de las reivindicaciones 10 a 13, que comprende transfectar células en cultivo en suspensión en condiciones exentas de suero con una molécula de ácido

nucleico recombinante según cualquiera de las reivindicaciones 3 a 9.

19. Método para producir la célula hospedadora según la reivindicación 14, que comprende transfectar células en cultivo en suspensión en condiciones exentas de suero con una primera molécula de ácido nucleico recombinante según la reivindicación 2 y una segunda molécula de ácido nucleico recombinante que comprende una

secuencia de ácido nucleico que codifica la cadena a de la hormona estimuladora del folículo (FSH) humana que se selecciona a partir del grupo que consiste en la región codificadora de la secuencia de ácido nucleico según SEQ ID NO: 2, teniendo las secuencias de ácido nucleico una identidad de secuencia de al menos el 85% con la región codificadora de la secuencia de ácido nucleico tal y como se describe en SEQ ID NO: 2 y la secuencia de ácido nucleico tal y como se describe en SEQ ID NO: 3.

20. Uso de una secuencia de ácido nucleico según SEQ ID NO: 1 o de las dos secuencias de ácido nucleico según SEQ ID NO: 1 y 2 para la producción in vitro de FSH humana recombinante.