Azúcares y nucleótidos modificados con polímeros ramificados.

compuesto que tiene una fórmula que es un miembro seleccionado de:

**Fórmula**

en la que

R1 es H, CH2OR7, COOR7 o OR7

en la que

d es 0 o 1;

R7 representa H, alquilo sustituido o insustituido o heteroalquilo sustituido o insustituido;

R2 10 es un miembro seleccionado de H, OH, un grupo activador y un resto que incluye un nucleótido.R3, R4, R5, R6 y R6' se seleccionan, de forma independiente de H, alquilo sustituido o insustituido, OR9 yNHC(O)R10

en los que

R9 y R10 se seleccionan de forma independiente de H, alquilo sustituido o insustituido o heteroalquilosustituido o insustituido;

al menos uno de R3, R4, R5, R6 y R6' incluye el resto que tiene la fórmula:**Fórmula**

Azúcares y nucleótidos modificados con polímeros ramificados Antecedentes de la invención Campo de la invención La presente invención reside en el campo de los azúcares modificados y nucleótidos de los mismos.

Antecedentes La modificación postexpresión in vitro de péptidos es una atractiva estrategia para remediar las deficiencias de los procedimientos que residen en controlar la glucosilación mediante sistemas de expresión de ingeniería, incluyendo tanto la modificación de estructuras de glicano como la introducción de glicanos en sitios nuevos. Esta apareciendo una herramienta exhaustiva de las glucosiltransferasas eucarióticas recombinantes, haciendo posible la síntesis enzimática in vitro de glucoconjugados de mamífero con patrones de glucosilación diseñados a medida y estructuras de glucosilo. Véase, por ejemplo, la patente de EE.UU. Nº 5.876.980; 6.030.815; 5.728.554; 5.922.577; y los documentos WO/9831826; US2003180835 y WO 03/031464.

Las síntesis basadas en enzimas tienen las ventajas de regioselectividad y estereoselectividad. Además, las síntesis enzimáticas se realizan usando sustratos no protegidos. En la síntesis de hidratos de carbono se usan tres clases principales, glucosiltransferasas (p. ej., sialiltransferasas, oligosacariltransferasas, N-acetilglucosaminiltransferasas) y glucosidasas. Las glucosidasas se clasifican además en exoglucosidasas (p. ej., º-manosidasa, º-glucosidasa) y endoglucosidasas (p. ej., Endo-A, Endo-M) . Cada una de estas clases de enzimas se han usado con éxito sintéticamente para preparar hidratos de carbono. Para una recapitulación general, véase Crout et al., Curr. Opin. Chem. Biol. 2: 98-111 (1998) .

Las glucosiltransferasas modifican las estructuras de oligosacáridos en los glucopéptidos. Las glucosiltransferasas son eficaces para producir productos específicos con buen control estereoquímico y regioquímico. Las glucosiltransferasas se han usado para preparar oligosacáridos y modificar las estructuras de hidratos de carbono unidos a N-terminal y O, en particular en glucopéptidos producidos en células de mamífero. Por ejemplo, los oligosacáridos terminales de los glucopéptidos se han sialilado y/o fucosilado por completo para proporcionar estructuras de azúcar más consistentes, lo que mejora la farmacodinámica de los glucopéptidos y otras varias propiedades biológicas. Por ejemplo, la º-1, 4-galactosiltransferasa se usó para sintetizar lactosamina, una ilustración de la utilidad de las glucosiltransferasas en la síntesis de hidratos de carbono (véase, por ejemplo, Wong et al., J. Org. Chem. 47: 5416-5418 (1982) ) . Además, numerosos procedimientos de síntesis han usado a-sialiltransferasas para transferir ácido siálico de ácido citidina-5’-monofosfo-N-acetilneuramínico al 3-OH o 6-OH de la galactosa (véase, por ejemplo, Kevin et al., Chem. Eur. J. 2: 1359-1362 (1996) ) . Las fucosiltransferasas se usan en las rutas sintéticas para transferir una unidad de mucosa de la guanosina-5’-difosfofucosa a un hidroxilo específico de un aceptor de sacáridos. Por ejemplo, Ichikawa preparó sialil Lewis-X mediante un procedimiento que implica la fucosilación de la lactosamina sialilada con una flucosiltransferasa clonada (Ichikawa et al., J. Am. Chem. Soc. 114: 9283-9298 (1992) ) . Para una discusión de los recientes avances en la síntesis de glucoconjugados para uso terapéutico, véase Koeller et al., Nature Biotechnology 18: 835-841 (2000) . Véase también la patente de EE.UU. Nº 5.876.980; 6.030.815; 5.728.554; 5.922.577; y el documento WO/9831826.

Además, para manipular la estructura de los grupos glucosilo en los polipéptidos, se ha desarrollado interés en la preparación de glucopéptidos que están modificados con uno o más grupos modificadores no sacáridos, tales como polímeros solubles en agua. El poli (etilenglicol) ( ("PEG") es un polímero ilustrativo que se ha conjugado con polipéptidos. Se ha demostrado que el uso de PEG para derivar péptidos terapéuticos reduce la inmunogenicidad de los péptidos. Por ejemplo, la patente de EE.UU. nº 4, 179, 337 (Davis et al.) divulga polipéptidos no inmunogénicos, tales como enzimas y hormonas peptídicas acopladas a polietilenglicol (PEG) o polipropilenglicol. Se usan entre 10 y 100 moles de polímero por mol de polipéptido. Aunque el tiempo de aclaramiento in vivo del conjugado es prolongado respecto al del polipéptido, solo se mantiene aproximadamente el 15% de la actividad fisiológica. Por tanto, la semivida en circulación prolongada se compensa con la espectacular reducción de la potencia del péptido.

La pérdida de actividad peptídica es atribuible directamente a la naturaleza no selectiva de las químicas usadas para conjugar el polímero hidrosoluble. El modo principal de unión de PEG y sus derivados a los péptidos es una unión inespecífica a través de un residuo de aminoácido del péptido. Por ejemplo, la patente de EE.UU. nº 4.088.538 divulga un conjugado enzima-polímero enzimáticamente activo de una enzima unida de forma covalente a PEG. De un modo similar, la patente de EE.UU. Nº 4.496.689 divulga un complejo unido covalentemente de un inhibidor de la proteinasa 1 con un polímero tal como PEG. Abuchowski et al. (J. Biol. Chem. 252: 3578 (1977) divulga la unión covalente de MPEF a un grupo amina de seroalbúmina bovina. La patente de EE.UU. Nº 4.414.147 divulga un procedimiento de hacer que el interferón sea menos hidrófobo conjugándolo con un anhídrido de un ácido dicarboxílico, tal como anhídrido poli (etilensuccínico) . La PCT WO 87/00056 divulga la conjugación de PEG y polioles poli (oxietilados) a proteínas tales como interferón-º, interleucina-2 e inmunotoxinas. El documento EP 154, 316 divulga y reivindica linfocinas químicamente modificadas, tales como IL-2 que contiene PEG unido directamente a al menos un grupo amino primario de la linfocina. La patente de EE.UU. Nº 4, 055, 635 divulga composiciones farmacéuticas de un complejo hidrosoluble de una enzima proteolítica unida covalentemente a una sustancia polimérica tal como un polisacárido.

Otro modo de unir PEG a los péptidos es a través de la oxidación inespecífica de residuos de glucosilo en un glucopéptido. El azúcar oxidado se usa como locus para unir un resto PEG al péptido. Por ejemplo, M'Timkulu (WO 94/05332) divulga el uso de un amino-PEG para añadir PEG a una glucoproteína. Los restos glucosilo se oxidan aleatoriamente a los correspondientes aldehídos que después se acoplan al amino-PEG.

En cada uno de los procedimientos descritos anteriormente, el poli (etilenglicol) se añade de un modo aleatorio inespecífico a residuos reactivos en una estructura peptídica. Para la producción de péptidos terapéuticos, es claramente deseable usar una estrategia de derivación que tenga como resultado la formación de un producto esencialmente homogéneo, específicamente marcado y fácilmente caracterizable. Una prometedora ruta para preparar péptidos marcados específicamente es a través del uso de enzimas, tales como glucosiltransferasas, para añadir un resto de azúcar modificado sobre un péptido. El resto de azúcar modificado debe funcionar como sustrato para la glucosiltransferasa y estar adecuadamente activado. Por tanto, las rutas sintéticas que proporcionan un fácil acceso a azúcares modificados activados son deseables. La presente invención proporciona dicha ruta.

Sumario de la invención La presente invención proporciona compuestos de acuerdo con las reivindicaciones adjuntas.

La presente invención proporciona especies poliméricas, azúcares y azúcares activados conjugados con estas especies poliméricas y azúcares de nucleótidos que incluyen estos polímeros. Los polímeros son polímeros de cadena ramificada.

El grupo modificador polimérico se puede unir en cualquier posición del resto azúcar. La invención se ilustra con referencia a una realización en la que el grupo modificador polimérico está unido al C-5 de una furanosa o al C-6 de una piranosa.

La invención proporciona un azúcar o un nucleótido de azúcar que está conjugado con un polímero de acuerdo con las reivindicaciones adjuntas.

En las fórmulas I y II, R1 es H, CH2OR7, COOR7 o OR7, en las que R7 representa H, alquilo sustituido o insustituido o heteroalquilo sustituido o insustituido. R2 es H, OH o un resto que incluye un nucleótido. Una especie de R2 de acuerdo con esta realización tiene la fórmula:

en la que R8 es un nucleósido.

Los símbolos R3, R4, R5, R6 y R6' representan de forma independiente H, alquilo sustituido o insustituido, OR9, NHC (O) R10. El índice d es 0 o 1. R9 y R10 se seleccionan de forma independiente de H, alquilo sustituido o insustituido, heteroalquilo sustituido o insustituido o... [Seguir leyendo]

1. Un compuesto que tiene una fórmula que es un miembro seleccionado de:

en la que R1 es H, CH2OR7, COOR7 o OR7 en la que d es 0 o 1; R7 representa H, alquilo sustituido o insustituido o heteroalquilo sustituido o insustituido;

R2 es un miembro seleccionado de H, OH, un grupo activador y un resto que incluye un nucleótido. R3, R4, R5, R6 y R6' se seleccionan, de forma independiente de H, alquilo sustituido o insustituido, OR9 y NHC (O) R10 en los que R9 y R10 se seleccionan de forma independiente de H, alquilo sustituido o insustituido o heteroalquilo sustituido o insustituido; al menos uno de R3, R4, R5, R6 y R6' incluye el resto que tiene la fórmula:

en la que s es un número entero de 0 a 20; y R11 es un resto modificador polimérico que tiene la fórmula:

en la que

X2 y X4 se seleccionan de forma independiente de S, SC (O) NH, HNC (O) S, SC (O) O, O, NH, NHC (O) , (O) CNH y NHC (O) O, OC (O) NH y (CH2) gY", en la que g es un número entero de 1 a 50; y Y" es un miembro seleccionado de O, S y NH;

X5 es un grupo protector no reactivo; y R12 y R13 son ramas poliméricas seleccionadas de forma independiente, teniendo dicho resto modificador polimérico tiene una fórmula seleccionada de: y

en las que e y f se seleccionan de forma independiente de 1 a 2.500,

2. El compuesto de acuerdo con la reivindicación 1, en el que R2 tiene la fórmula:

en la que R8 es un nucleósido.

3. El compuesto de acuerdo con la reivindicación 2, en el que R8 es un miembro seleccionado de citidina, uridina, guanosina, adenosina y timidina.

4. (Modificada) El compuesto de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones precedentes que tiene la fórmula:

en la que D es un miembro seleccionado de -OH y (R11) w'-L-; G representa un miembro seleccionado de (R11) w'-L- y -C (O) alquilo (C1-C6) . w' es un número entero de 2 a 6; y

al menos uno de D y G es (R11) w'-L-, en la que L es un miembro seleccionado de un enlace y un grupo de unión seleccionado de restos alquilo sustituido o insustituido y heteroalquilo sustituido o insustituido.

5. El compuesto de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones precedentes, siendo dicho compuesto un sustrato de una enzima que transfiere un resto de azúcar de un miembro seleccionado de un azúcar activado, un azúcar de nucleótido y combinaciones de los mismos a un resto aceptor de un sustrajo.

6. El compuesto de acuerdo con la reivindicación 5 en el que dicho resto aceptor es un miembro seleccionado de un residuo glicosilo, un residuo de aminoácido y una aglicona.

7. El compuesto de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones precedentes que tiene la fórmula:

en la que AA es -CH2-; y NP es un nucleótido fosfato.

FIGURA 1A FIGURA 1B FIGURA 1C FIGURA 1D FIGURA 1E FIGURA 1F FIGURA 1G FIGURA 1H FIGURA 1I FIGURA 1J FIGURA 1K FIGURA 1L FIGURA 1M FIGURA 1N