EXPRESIÓN DE GLICOSILTRANSFERASAS EUCARIOTAS ACTIVAS, SOLUBLES EN ORGANISMOS PROCARIOTAS.

Expresión de glicosiltransferasas eucariotas activas, solubles en organismos procariotas. Campo de la invención La presente invención proporciona métodos mejorados para la producción de glicosiltransferasas eucariotas activas, solubles en microorganismos procariotas que tienen un entorno oxidante. Antecedentes de la invención Los organismos eucariotas sintetizan estructuras de oligosacáridos o glicoconjugados, tales como glicolípidos o glicoproteínas, que son comercial y terapéuticamente útiles. La síntesis in vitro de oligosacáridos o glicoconjugados puede llevarse a cabo usando glicosiltransferasas eucariotas recombinantes. El método más eficaz para producir muchas proteínas recombinantes es expresar la proteína en bacterias. Sin embargo, en bacterias, muchas glicosiltransferasas eucariotas se expresan como proteínas insolubles en cuerpos de inclusión bacterianos, y los rendimientos de proteína glicosiltransferasa eucariota activa a partir de los cuerpos de inclusión pueden ser muy bajos. Además, muchas glicosiltransferasas eucariotas se expresan como proteínas glicosiladas en sus células de origen. Por tanto, se cree que la expresión de las proteínas en bacterias no incluiría patrones de glicosilación nativos, disminuyendo además la esperanza de expresión de proteína glicosiltransferasa eucariota activa. Véase, por ejemplo, Breton et al., Biochimie 83:713-718 (2001). Por tanto, existe una necesidad de métodos mejorados para producir glicosiltransferasas eucariotas enzimáticamente activas en organismos procariotas, tales como, por ejemplo, bacterias. La presente invención soluciona esta y otras necesidades. Breve sumario de la invención En un aspecto, la presente invención proporciona un método de producción de una glicosiltransferasa eucariota activa soluble según la reivindicación 1. En una realización, la glicosiltransferasa eucariota es un miembro seleccionado de una Nacetilglucosaminiltransferasa I (GnT o GNT) eucariota, una N-acetilgalactosaminiltransferasa (GalNAcT) eucariota, una galactosiltransferasa (GalT) eucariota y una sialiltransferasa eucariota. Los ejemplos de cada una de estas clases de enzimas incluyen, por ejemplo, para una N-acetilglucosaminiltransferasa eucariota proteínas GnT1, BGnT- I, GnT-II, GnT-III, GnT-IV (por ejemplo, GnT-IVa y GnT-IVb), GnT-V, GnT-VI, GnT-IVH, MGNT1 y OGT; para una Nacetilgalactosaminiltransferasa eucariota proteínas GalNAc-T2, GalNAc-T1 y GalNAc-T3; para una galactosiltransferasa (GalT) eucariota una ß-1,4-galactosiltransferasa (GalT1) eucariota o una core 1 galactosiltransferasa (core 1 GalT1) eucariota; para una sialiltransferasa eucariota, una (2,3)sialiltransferasa (ST3Gal3) eucariota, una -N-acetilgalactosaminida -2,6-sialiltransferasa I (ST6GalNAcT1) eucariota o una gal ß1,3GalNAc 2,3-sialiltransferasa (ST3GalI) eucariota. Algunos ejemplos preferidos de glicosiltransferasas eucariotas para su uso en la invención incluyen una Nacetilglucosaminiltransferasa I (GnT1 o GNTI) eucariota, una N-acetilgalactosaminiltransferasa (GalNAcT) eucariota, por ejemplo, una GalNAcT1, GalNAcT2 o GalNAcT3, una ß-1,4-galactosiltransferasa (GalT1) eucariota, una -2,3- sialiltransferasa (ST3Gal3) eucariota, una -N-acetilgalactosaminida -2,6-sialiltransferasa I (ST6GalNAc-1) eucariota, una gal ß1,3GalNAc 2,3-sialiltransferasa (ST3Gal-1) eucariota y una core 1 galactosiltransferasa (Core- 1-GalT-1) eucariota. En una primera realización el microorganismo procariota es una bacteria de E. coli o una de Pseudomonas que tiene un entorno oxidante. Por ejemplo, la E. coli puede manipularse para inactivar ácidos nucleicos de reductasa genómicos o endógenos, por ejemplo, un gen txrB y un gen gor. Otras cepas de E. coli que pueden usarse incluyen, por ejemplo, una cepa mutante trxB gor supp o una cepa mutante trxB gshA supp, ambas de las cuales se dan a conocer en la patente estadounidense n.º 6.872.563. En una realización adicional, el microorganismo procariota, por ejemplo, células de E. coli o células de Pseudomonas, se hacen crecer a una temperatura entre 12-30ºC mientras se expresa la glicosiltransferasa eucariota. El microorganismo procariota también puede expresar proteínas adicionales para potenciar la solubilidad de la glicosiltransferasa eucariota, por ejemplo una proteína disulfuro isomerasa (PDI) heteróloga o una proteína chaperona heteróloga, o tanto una PDI heteróloga como una proteína chaperona heteróloga. En otra realización, el método comprende además la etapa de aislar la glicosiltransferasa eucariota. En realizaciones adicionales, la glicosiltransferasa eucariota comprende una etiqueta de purificación, por ejemplo, un dominio de proteína de unión a maltosa o un dominio de proteína de unión a almidón. En realizaciones adicionales, la glicosiltransferasa eucariota soluble se produce a escala comercial. La escala comercial incluye la preparación de una cantidad suficiente de enzima para producir un producto glicosilado a una escala comercial (microgramo, miligramo o gramo). Breve descripción de los dibujos La figura 1 demuestra el análisis de SDS-PAGE de la expresión y purificación parcial de ST3Gal-1 porcina truncada 2   etiquetada con MBP soluble. Se expresó MBP-ST3Gal-1 en las cepas mutantes JM109 (carriles 2-5) y trxB gor supp (carriles 6-9). Los carriles 2-3 y 6-7 son lisados clarificados antes y tras la incubación con resina de amilosa, respectivamente. Los carriles 4-5 y 8-9 son eluciones en serie de la resina de amilosa que contienen MBP-ST3Gal-1 parcialmente purificada. En el primer carril están los marcadores de peso molecular. La figura 2a demuestra el análisis de SDS-PAGE de la expresión y purificación parcial de GalNAc-T2 humana truncada etiquetada con MBP soluble a partir de lisados mutantes de txrB gor supp (carriles 2-4). Los carriles 2-3 son lisados clarificados antes y tras la incubación con resina de amilosa, respectivamente. El carril 4 es la elución de la resina de amilosa que contiene MBP-GalNAc-T2 parcialmente purificada. En el primer carril están los marcadores de peso molecular. La figura 2b demuestra el análisis de SDS-PAGE de la expresión y solubilidad de GalNAc-T2 humana truncada en los extremos amino y carboxilo terminales expresada en E. coli mutante trxB gor supp. Se separaron las células lisadas mediante centrifugación en fracciones insolubles (carril 2) y solubles (carril 3) y se resolvieron mediante SDS-PAGE. En el primer carril están los marcadores de peso molecular. La figura 3 demuestra el análisis de SDS-PAGE de la expresión y purificación parcial de Core-1-Gal-T1 de Drosophila truncada etiquetada con MBP soluble. Se expresó MBP-Core-1-Gal-T1 y se purificó a partir de células mutantes JM109 (carriles 2-3) y trxB gor supp (carriles 4-5). El carril 1 contiene marcadores de peso molecular. Los carriles 2 y 4 son lisados clarificados y se muestran las eluciones de resina de amilosa parcialmente purificada en los carriles 3 y 5. La figura 4 demuestra el análisis de SDS-PAGE de la expresión y purificación parcial de ST6GalNAc-1 humana truncada etiquetada con MBP soluble a partir de células mutantes trxB gor supp. El carril 1 contiene marcadores de peso molecular. Los carriles 2 y 3 son lisados clarificados antes y tras la incubación con resina de amilosa, respectivamente. El carril 4 contiene MBP-ST6GalNAc-1 parcialmente purificada eluida de la resina de amilosa. La figura 5 proporciona los rendimientos de actividad expresada a partir de experimentos de producción de aumento a escala para MBP-GalNAc-T2, MBP-Core-1-Gal-T1 y MBP-ST3Gal-1. Se indujeron recipientes de fermentación de diez litros sembrados con células mutantes trxB gor supp que expresaban el constructo indicado durante 48 horas. Se monitorizó la actividad glicosiltransferasa (U/litro de medio) a partir de alícuotas tomadas en los tiempos indicados tras la inducción. La figura 6 demuestra la glicosilación de interferón-alfa-2b usando glicosiltransferasas eucariotas producidas en E. coli mutante trxB gor supp. Se analizaron los productos de reacción mediante espectrometría de masas MALDI TOF. La figura 6A muestra interferón-alfa-2b no modificado. La figura 6B muestra el resultado de la incubación con MBP- GalNAc-T2 y UDP-GalNAc. La figura 6C muestra el resultado de la incubación con MBP-GalNAc-T2, MBP-Core-1- Gal-T1, UDP-GalNAc y UDP-Gal. Se observó la masa esperada debido a la adición de GalNAc (esperada +203,2, observada +209,1) o GalNAc-Gal (esperada +365,6, observada +365,3) a interferón-alfa-2b. La figura 7 demuestra el análisis de SDS-PAGE de una reacción de glicoPEGilación usando glicosiltransferasas eucariotas producidas en E. coli mutante trxB gor supp. En primer lugar, se incubó interferón-alfa-2b (carril 2) con MBP-GalNAc-T2, MBP-Core-1-Gal-T1, UDP-GalNAc y UDP-Gal durante seis horas a 32ºC (carril 3). Entonces, se añadieron MBP-ST3Gal-1 y CMPSA-40kDa-PEG purificadas... [Seguir leyendo]

1. Método de producción de una glicosiltransferasa eucariota activa soluble en un microorganismo procariota, en el que el microorganismo procariota tiene un entorno oxidante, comprendiendo el método las etapas de a) expresar un ácido nucleico que codifica para la glicosiltransferasa eucariota en el microorganismo procariota; y b) hacer crecer el microorganismo en condiciones que permiten la expresión de la glicosiltransferasa eucariota activa soluble dentro de un compartimiento celular del microorganismo procariota, en el que el microorganismo procariota tiene actividad reductasa ausente o reducida que resulta de una mutación en un ácido nucleico de reductasa endógeno, y se hace crecer a una temperatura inferior a una temperatura de crecimiento óptima. 2. Método de la reivindicación 1, en el que la glicosiltransferasa eucariota es un miembro seleccionado del grupo que consiste en una N-acetilglucosaminiltransferasa I (GnT o GNT) eucariota, una Nacetilgalactosaminiltransferasa sialiltransferasa eucariota. (GalNAcT) eucariota, una galactosiltransferasa (GalT) eucariota y una 3. Método de la reivindicación 2, en el que la galactosiltransferasa (GalT) eucariota es una ß-1,4galactosiltransferasa (GalT1) eucariota o una core 1 galactosiltransferasa (core 1 GalT1) eucariota; la sialiltransferasa eucariota es una (2,3)sialiltransferasa (ST3Gal3) eucariota, una -N-acetilgalactosaminida -2,6sialiltransferasa I (STßGalNAcT1) eucariota, o una Gal ß1,3GalNAc 2,3-sialiltransferasa (ST3GalI) eucariota. 4. Método de la reivindicación 1, en el que el microorganismo procariota es una E. coli. 5. Método de la reivindicación 4, en el que la E. coli tiene una mutación en un gen txrB y un gen gor y se hace crecer a una temperatura entre 12-30ºC. 6. Método de la reivindicación 1, que comprende adicionalmente la etapa de aislar la glicosiltransferasa eucariota activa, soluble. 7. Método de la reivindicación 1, en el que la glicosiltransferasa eucariota activa soluble se produce en una escala de microgramos, miligramos o gramos. 8. Método de la reivindicación 1, en el que la glicosiltransferasa eucariota activa soluble comprende una etiqueta de purificación. 9. Método de la reivindicación 1, en el que el microorganismo procariota comprende una proteína disulfuro isomerasa (PDI) heteróloga. 10. Método de la reivindicación 1, en el que el microorganismo procariota comprende una proteína chaperona heteróloga. 82   83   84     86   87   88   89     91   92