MÉTODO PARA UNA BIOTINILACIÓN ESPECÍFICA DE SECUENCIA DE POLIPÉPTIDOS IN VITRO.

Método para una biotinilación específica de secuencia de polipéptidos in vitro . La invención se refiere a un método mejorado para la biotinilación específica de secuencia de polipéptidos. El enzima biotina holoenzima sintetasa (BirA) de E. coli (una biotina ligasa) cataliza la adición covalente in vivo del grupo -amino de una cadena lateral de lisina en su sustrato natural, la proteína portadora de carboxilo biotina (BCCP) (Cronan J.E. Jr. et al., J. Biol. Chem. 265:10327-10333, 1990). En E. coli únicamente la BCCP se encuentra biotinilada.Esta proteína es una subunidad de la acetil-CoA-carboxilasa. La reacción se encuentra catalizada por la biotina proteína ligasa BirA, el producto del gen qrA (Cronan J.E. Jr., Cell 58:427-429, 1989). La biotinilación de proteínas con un enzima de biotinilación también por medios recombinantes se describe en la patente WO nº 95/04069. La biotinilación enzimática específica de secuencia utilizando BirA también se describe para los polipéptidos recombinantes durante la expresión en E. coli (Tsao K.-L. et al., Gene 169:59-64, 1996). Altman J.D. et al., Science 274:94-96, 1996, describen la biotinilación enzimática de polipéptidos aislados in vitro utilizando también BirA. Sin embargo, dicho método resulta muy laborioso, requiriendo un número considerablemente superior de etapas de purificación en comparación con la biotinilación in vivo. En primer lugar, la proteína debe prepararse, aislarse y purificarse. A continuación, se lleva a cabo la biotinilación, y después, se lleva a cabo otra purificación. Parrott M.B. y Barry M.A., Biochem. Biophys. Res. Communications 281:993-1000, 2001, describen la biotinilación metabólica de proteínas secretadas y de superficie celular procedentes de células de mamífero utilizando el enzima endógeno biotina ligasa de la célula de mamífero. Saviranta P. et al., Bioconjug. Chem. 9:725-735, 1998, describen la biotinilación enzimática in vitro de fragmentos Fab recombinantes a través de una cola aceptora peptídica.Las proteínas se produjeron recombinantemente en E. coli, se purificaron y posteriormente se bionilaron in vitro con BirA. Tras la eliminación de los fragmentos Fab no biotinilados, el rendimiento global de Fab biotinilado era del 40%. La biotinilación tanto in vitro como in vivo de los polipéptidos heterólogos utilizando biotina ligasas tales como BirA adolece de varias desventajas. Mientras que la biotinilación in vitro requiere mucho tiempo y es laboriosa, la biotinilación in vivo resulta en productos que contienen cantidades considerables de BCCP. Resulta difícil separar la BCCP biotinilada de la mayoría de los polipéptidos biotinilados deseados, y no puede separarse de los mismos por completo. Es el objetivo de la invención proporcionar un método mejorado y simple para la biotinilación enzimática específica de polipéptidos que proporciona polipéptidos específicamente biotinilados de alta pureza a rendimiento elevado y de elevada actividad. Descripción resumida de la invención La invención proporciona un método para la síntesis de un polipéptido biotinilado caracterizado porque la síntesis se lleva a cabo en una mezcla de reacción de síntesis peptídica libre de células que contiene un lisado celular que contiene ribosomas procedente de células procarióticas o eucarióticas, mediante la traducción o transcripción/traducción de ácidos nucleicos codificantes del polipéptido y BirA, mientras que la mezcla de reacción contiene biotina. Inesperadamente se encontró que la actividad de los polipéptidos, biotinilados según el método de la invención, era más alta que la actividad observada para dichos polipéptidos biotinilados en un sistema celular de fermentación in vivo. Por lo tanto, la invención proporciona un método para preparar un polipéptido biotinilado en una mezcla de reacción de síntesis peptídica libre de células que contiene ribosomas, ARNt, ATP, GTP, nucleótidos, aminoácidos y BirA en forma de ácido nucleico, caracterizado porque: a) el ácido nucleico se expresa para formar dicho polipéptido que contiene una secuencia de sustrato de holocarboxilasa sintetasa (BirA) etiquetada en el extremo N-terminal o Cterminal, y BirA en forma de ácido nucleico se expresa en la mezcla de reacción, proporcionando el polipéptido BirA; b) dicho polipéptido se biotinila en presencia de biotina y BirA, c) dicho polipéptido biotinilado se aísla de dicha mezcla, o dicha mezcla se incuba con avidina o estreptavidina inmovilizada bajo condiciones en las que dicho polipéptido biotinilado se une a dicha avidina o estreptavidina inmovilizada. Preferentemente, los ribosomas se proporcionan en forma de lisado celular, preferentemente en forma de lisado de E. coli. Descripción detallada de la invención El método según la invención proporciona un método mejorado para la producción de un polipéptido (polipéptido de 2   interés) que se biotinila específicamente en una secuencia N-terminal o C-terminal de etiqueta mediante biotinilación enzimática específica de sitio. Preferentemente, el polipéptido presenta un peso molecular de entre aproximadamente 8kDa y aproximadamente 120 kDa, preferentemente de una longitud de entre aproximadamente 100 y 400 aminoácidos. Según la invención inesperadamente resulta posible producir dichos polipéptidos biotinilados sin contaminación sustancial de proteína portadora de carboxilo biotina (BCCP) y sin aislamiento intermedio del polipéptido no biotinilado en el caso de que se utilice una mezcla de reacción de síntesis peptídica libre de células para la síntesis polipeptídica. Una "mezcla de reacción de síntesis peptídica libre de células" según la invención se encuentra descrita en el estado de la técnica y es un lisado libre de células procedente de células procarióticas o eucarióticas, que contiene ribosomas, ARNt, ATP, GTP, nucleótidos y aminoácidos. Un procariótica preferente es E. coli. La síntesis polipeptídica libre de células es un método que se ha conocido en el estado de la técnica desde hace mucho tiempo. Spirin et al. desarrollaron en 1988 una traducción libre de células en flujo continuo (CFCF) y sistema acoplado de transcripción/traducción en el que se produce una cantidad relativamente alta de síntesis de proteínas (Spirin A.S. et al., Science 242:1162-1164, 1988).Para dicha síntesis de proteínas libre de células, se utilizaron lisados celulares que contenían ribosomas para la traducción o transcripción/traducción. Dichos extractos libres de células de E. coli fueron desarrollados por, por ejemplo, Zubay G., Ann. Rev. Genetics 7:267-287, 1973, y utilizados por Pratt J.M. et al., Nucleic Acids Research 9:4459-4479, 1981, y Pratt et al., Transcription and Translation: A Practical Approach, Hames y Higgins (editores), páginas 179 a 209, IRL Press, 1984. Se describen desarrollos adicionales de la síntesis de proteínas libre de células en las patentes US nº 5.478.730, US nº 5.579.690, EP nº 0 932 664, WO nº 99/50436, WO nº 00/58493 y WO nº 00/55353. Los sistemas de expresión libres de células eucarióticos se describen en, por ejemplo, Skup D. y Millward S., Nucleic Acids Research 4:3581-3587, 1977; Fresno M. et al., Eur. J. Biochem. 68:355-364, 1976; Pelham H.R. y Jackson R.J., Eur. J. Biochem. 67:247-256, 1976, y en la patente WO nº 98/31827. La holocarboxilasa sintetasa (EC6.3.4.15, biotina proteína ligasa (BPL), BirA) es un enzima responsable de la unión covalente de la biotina a proteína afín. La biotina ligasa es altamente específica y reacciona únicamente en proteínas que muestran un grado muy elevado de conservación de la estructura primaria del dominio de unión a biotina. Este dominio incluye preferentemente el tetrapéptido AMKM altamente conservado (Chapman-Smith A. y Cronan J.E. Jr., J. Nutr. 129, 2S supl.:477S-484S, 1999). El enzima BirA recombinante se describe en la patente WO nº 99/37785. Se añade BirA a la mezcla de reacción en forma de ácido nucleico (en un vector de expresión, por ejemplo ARN o ADN) que se expresa (transcribe/traduce) en el sistema en forma de proteína de interés. La cantidad de ácido nucleico depende de la tasa de expresión del vector utilizado y de la cantidad necesaria de enzima BirA en la mezcla de reacción. Un ng de plásmido de ADN de BirA (por ejemplo basado en un vector de expresión E. coli disponible comercialmente, tal como los vectores pIVEX, http://www.bio-chem.roche.com/RTS), o incluso menos, resulta suficiente para una reacción cuantitativa de biotinilación de proteínas fusionadas con un péptido sustrato de biotinilación de BirA.El rendimiento máximo de proteína de fusión expresada y específicamente biotinilada se consigue mediante la adición del plásmido de ADN codificante de la proteína diana deseada en una cantidad de entre 10 y 15 g, y la introducción del plásmido... [Seguir leyendo]

1. Método para preparar un polipéptido biotinilado en una mezcla de reacción de síntesis peptídica libre de células que contiene ribosomas, ARNt, ATP, GTP, nucleótidos, aminoácidos y BirA en forma de ácido nucleico, caracterizado porque: a) el ácido nucleico se expresa para formar dicho polipéptido que contiene una secuencia de sustrato de holocarboxilasa sintetasa (BirA) etiquetada en el extremo N-terminal o C-terminal, y BirA en forma de ácido nucleico se expresa en dicha mezcla de reacción, proporcionando el polipéptido BirA; b) dicho polipéptido se biotinila en presencia de biotina y BirA, c) dicho polipéptido biotinilado se aísla a partir de dicha mezcla, o dicha mezcla se incuba con avidina o estreptavidina inmovilizada bajo condiciones en las que dicho polipéptido biotinilado se une a dicha avidina o estreptavidina inmovilizada. 2. Método según la reivindicación 1, caracterizado porque la proporción de ADN codificante de polipéptido y ADN codificante de BirA es de 1.500:1,50. 13   14