Método e inmunoabsorbentes para la detección específica y la absorción de anticuerpos asociados a la celiaquía y a la dermatitis herpetiforme.

Polipéptido, que contiene uno o varios péptidos conforme a SEQ ID NO:

2 y uno o varios péptidos conforme aSEQ ID NO: 3, habiéndose podido suprimir en cada caso hasta 30% de los aminoácidos o intercambiar por unreemplazamiento conservativos de aminoácidos, y/o pudiéndose solapar en parte SEQ ID NO: 2 y SEQ IDNO: 3, caracterizado porque comprende uno o varios polipéptidos 5 constituidos por al menos 14, al menos 15o al menos 16 aminoácidos sucesivos en SEQ ID NO 4, o que comprende uno o varios polipéptidos conformea SEQ ID NO 4.

Tipo: Patente Internacional (Tratado de Cooperación de Patentes). Resumen de patente/invención. Número de Solicitud: PCT/DE2008/000713.

Solicitante: EUROIMMUN MEDIZINISCHE LABORDIAGNOSTIKA AG.

Nacionalidad solicitante: Alemania.

Dirección: SEEKAMP 31 23560 LÜBECK ALEMANIA.

Inventor/es: PROBST,Christian, SCHLUMBERGER,Wolfgang, STÖCKER,Winfried, DÄHNRICH,Cornelia, KOMOROWSKI,Lars, MOTHES,Thomas.

Fecha de Publicación: .

Clasificación Internacional de Patentes:

  • G01N33/564 SECCION G — FISICA.G01 METROLOGIA; ENSAYOS.G01N INVESTIGACION O ANALISIS DE MATERIALES POR DETERMINACION DE SUS PROPIEDADES QUIMICAS O FISICAS (procedimientos de medida, de investigación o de análisis diferentes de los ensayos inmunológicos, en los que intervienen enzimas o microorganismos C12M, C12Q). › G01N 33/00 Investigación o análisis de materiales por métodos específicos no cubiertos por los grupos G01N 1/00 - G01N 31/00. › para complejos inmunológicos preexistentes o enfermedades autoinmunes.

PDF original: ES-2386228_T3.pdf

 


Fragmento de la descripción:

Metodo e inmunoabsorbentes para la deteccion especifica y la absorcion de anticuerpos asociados a la celiaquia y a la dermatitis herpetiforme.

La presente invencion se refiere a los peptidos de fusion que se derivan de componentes de la gliadina, a los reactivos de ensayo para la deteccion diagnostica de anticuerpos contra estos peptidos y a los procedimientos para la inmunoabsorcion de tales anticuerpos para la terapia de la celiaquia y de la dermatitis herpetiforme.

Estado actual de la tecnica:

En los pacientes con intolerancia al gluten (enteropatia sensible al gluten; ninos pequenos: celiaquia, adultos: esprue endemico; celiaquia se utiliza tambien en el marco de la presente solicitud como sinonimo de la enteropatia sensible al gluten dependiente de la edad) por el consumo de productos de cereales que contienen gluten se provoca un deterioro de la mucosa del intestino delgado. Se llega a una at rofia de las vellosidades y a perturbaciones funcionales. El cuadro clinico esta marcado por la diarrea y las consecuencias de la malabsorcion (especialmente perdida de peso; en ninos retraso del crecimiento) . En algunos pacientes con enteropatia sensible al gluten existe adicionalmente una dermatitis herpetiforme de Duhring: una enfermedad cronica de la piel que transcurre con formacion de ampollas, pero que tambien puede aparecer por si sola.

Una importante contribucion para el diagnostico de la enteropatia sensible al gluten y de la dermatitis herpetiforme de Duhring la aporta el examen de dos anticuerpos diferentes: antigliadina y antitransglutaminasa tisular. Este asegura el diagnostico clinico y, ademas, es adecuado para el control de su transcurso y para el control de una dieta exenta de gluten o de una prueba de carga de gluten. Una diferenciacion especifica de estos dos anticuerpos a partir del plasma de los pacientes puede conllevar un efecto terapeutico positivo.

Durante la fase aguda de la enfermedad de la enteropatia sensible al gluten, asi como en la dermatitis herpetiforme se pueden detectar generalmente anticuerpos de gliadina de las clases IgA e IgG. Eventualmente, tambien se pueden detectar anticuerpos de la clase IgM, pero por lo regular solo cuando se presentan tambien al mismo tiempo anticuerpos antigliadina de las clases IgA e IgG.

Al comienzo de una dieta exenta de gluten los anticuerpos IgA antigliadina disminuyen ya al cabo de unos pocos meses a valores bajos, mientras que los anticuerpos de la clase IgG persisten por lo regular durante mas tiempo. Niveles permanentemente elevados de anticuerpos IgA antigliadina significan que no se sigue una dieta exenta de gluten. Bajo carga de gluten, en el caso de una recidiva, se llega en el espacio de unos pocos dias a un incremento de los anticuerpos IgG antigliadina, los anticuerpos IgA siguen algo mas tarde.

La funcion fisiologica de la transglutaminasa tisular consiste en la catalisis de la formacion de un enlace isopeptidico entre un grupo y-carboxamida de un grupo glutamina y el grupo £-amino de un radical lisina de las proteinas de la matriz extracelulares, por lo que estas se reticulan en cruz (Aeschlimann et al. 2000 Conective Tissue Res. 41;1-27; Gentile et al. 2002. Neurochem Int. 40: 79-83) .

Las gliadinas ricas en glutamina ingeridas con el alimento se pueden modificar igualmente despues de la resorcion por la glutaminasa tisular. Sin embargo, aqui tiene lugar preferentemente la desamidacion enzimatica de radicales glutamina a radicales glutamato (recopilado en Schwertz et al. 2004 Clinical Chemistr y 50:2370-2375) . Esta da lugar a una union mas fuerte de los peptidos de gliadina a moleculas de clase MHC II y, por ello, a una estimulacion incrementada de celulas T en pacientes con celiaquia (Sjostrom et al. 1998. Scand J Gastroenterol. 48: 111-115; Molberg et al. 1998. Nat Med. 4:713-717) .

Como epitope importante para anticuerpos de la clase IgA, especialmente de partes de la gliadina desamidada, se identifico el tripeptico prolina-glutamato-glutamina (PEQ) (Osman et al. 2000. Clin. Exp. Immunol. 121:248-254) . Se puso de manifiesto, que la gliadina desamidada es reconocida por los anticuerpos de pacientes con celiaquia de forma mas especifica que la gliadina no modificada (Aleanzi et al. 2001. Clin Chem. 47:2023-2028) . Para la deteccion de anticuerpos contra un peptido desamidado derivado de la gliadina en el caso de celiaquia, se obtuvo por los autores, para anticuerpos de la clase IgA, una sensibilidad de 95, 0% con una especificidad de 86, 7% y para anticuerpos de la clase IgG, una sensibilidad de 90, 0% con una especificidad de 86, 7%, en relacion a una enfermedad de celiaquia (vease tabla 1, a) .

En el marco de un analisis sistematico de la union de anticuerpos asociados a la celiaquia de la clase IgA a antigenos sinteticos, presuntamente derivados de la gliadina, se identificaron dos nonapeptidos correspondientes a la secuencia SEQ-ID NO 2 (Pro Leu Gln Pro Glu Gln Pro Phe Pro) y SEQ-ID NO 3 (Pro Glu GLn Leu Pro Gln Phe Glu Glu) como antigenos mejor adecuados. (Schwertz et al. 2004. Clinical Chemistr y 50:2370-2375. La sintesis de estos dos peptidos (segun Kramer et al. 1998. J. Methods Mol. Biol. 87:25-39) tuvo lugar quimicamente por separado, uno al lado de otro, sobre una membrana de celulosa que fue empleada a continuacion directamente en un ensayo quimioluminiscente para la union de anticuerpos asociados a la celiaquia El procedimiento es conocido a partir de la preparacion de bancos de peptidos basados en membrana en el marco de estudios de mapas de epitopos. Los correspondientes reactivos para la deteccion de anticuerpos en la produccion de sistemas de ensayo diagnosticos conducen a elevados costes de produccion.

Prescindiendo de ellos, Schwertz et al. realizaron dos ELISA basados en membrana para la deteccion de anticuerpos de la clase de inmunoglobulinas IgA antigliadina en el caso de celiaquia, con deteccion por quimioluminiscencia, los cuales en una evaluacion combinada de los dos antigenos correspondientes a SEQ ID NO 2 ySEQ ID NO 3 mostraron conjuntamente (vease tabla 1. b) una sensibilidad de 94, 2% con una especificidad de

5 93, 4%.

La deteccion por quimioluminiscencia es complejay esta obligada a caros aparatos de analisis.No se indico, si los datos de resultados diagnosticos podian ser alcanzados tambien con los procedimientos de deteccion colorimetricos, ampliamente extendidos. Los propios autores senalan esta desventaja y proponen para la ulterior mejora de su sistema de ensayo una nueva optimacion de la secuencia, asi como la comprobacion del sistema de quimioluminiscencia basado en membrana en el formato de placas para microtitulacion, sin haber resuelto este problema.

Schwertz et al. solo incluyeron en el estudio sueros positivos de transglutaminasa tisular IgA. Las muestras de pacientes con carencia selectiva de IgA no conducen en el caso de Schwertz et al. a una di sminucion de la sensibilidad como en el caso de una seleccion de pacientes de resultados abiertos, de manera que aqui hay que suponer una sensibilidad demasiado alta, realizada incorrectamente, del orden de medidas de 3-5%. Los datos de los resultados se basan, ademas, en una evaluacion combinada de dos determinaciones separadas, de mala validez para rutinas, basadas en las secuencias peptidicas SEQ ID NO 2, respectivamente SEQ ID NO 3.

Un ELISA basado en placas para microtitulacion para la determinacion de anticuerpos de la clase IgG en base de uno (conforme a la secuencia SEQ ID NO 2) de los dos nonapeptidos demostro igualmente en un estudio (Prause et

al. 2007. Posterbeitrag zur 22. Jahrestagung der gesellschaft fur padiatrische Gastroenterologie und Ernahrung, Bochum) una mejora frente el estado actual de la tecnica para la determinacion de anticuerpos de la clase IgG, para IgA no se mostraron resultados (vease tabla 1, c) .

En el estudio de Schwertz et al. se ha puesto de manifiesto, que la determinacion de anticuerpos llevada a cabo por separado, pero evaluada de forma combinada empleando los peptidos conformes a SEQ ID NO 2 y SEQ ID NO 3, 25 hace posibleuna mejoradel diagnostico serologicode la celiaquia. Los datos de los resultados del trabajo de Aleanzi et al. fueron superados claramente por Schwertz et al. Pero en el caso de Schwertz et al. se tienen que hacer al menosdos sintesis y determinaciones separadas (antigenos correspondientes a SEQ ID NO 2 ySEQ ID NO 3) , lo cual ocasiona el doble coste en material y trabajo. Seria posible mezclar los dos antigenos peptidicos y emplear la mezcla para el recubrimiento de la fase solida en el ELISA. Pero tales ensayos estan afectados por una escasa reproducibilidad, un incremento... [Seguir leyendo]

 


Reivindicaciones:

REIVINDICACIONES?

:Cº Polipeptido, que contiene uno o varios peptidos conforme a SEQ ID NO: 2 y uno o varios peptidos conforme a SEQ ID NO: 3, habiendose podido suprimir en cada caso hasta 30% de los aminoacidos o intercambiar por un reemplazamiento conservativos de aminoacidos, y/o pudiendose solapar en parte SEQ ID NO: 2 y SEQ ID NO: 3, caracterizado porque comprende uno o varios polipeptidos constituidos por al menos 14, al menos 15 o al menos 16 aminoacidos sucesivos en SEQ ID NO 4, o que comprende uno o varios polipeptidos conforme a SEQ ID NO 4. :Cº Polipeptido segun la reivindicacion 1, que comprende tres polipeptidos conforme a SEQ ID NO: 4. 3Cº Polipeptido segun una de l conforme a SEQ ID NO: 7. as reivindicaciones precedentes, que c omprende u no o va rios polipeptidos 7Cº Polipeptido segun una de las reivindicaciones precedentes en forma de un polimero que comprende 2 a 20 polipeptidos. 5Cº Polipeptido s egun una d e l as reivindicaciones precedentes, ca racterizado porque se pr epara de f orma recombinante o con medios bioquimicos convencionales de sintesis de polipeptidos. ºCº Polipeptido segun una de las reivindicaciones precedentes, caracterizado porque esta unido con una molecula reportera o con una fase solida. 7Cº Procedimiento para el diagnostico de celiaquia y/o dermatitis herpetiforme, caracterizado porque una muestra biologica l iquida de un p aciente se p one en co ntacto con un o o va rios polipeptidos segun un a de l as reivindicaciones precedentes, pudiendo tener lugar la union de los anticuerpos de la muestra biologica a estos polipeptidos, de modo que por la deteccion de anticuerpos contra uno de estos polipeptidos se diagnostica una celiaquia o una dermatitis herpetiforme. 8Cº Procedimiento se gun l a r eivindicacion 7, ca racterizado por que se utiliza una m ezcla de al m enos dos polipeptidos diferentes segun una de las reivindicaciones 1 a 6. ºCº Procedimiento segun la reivindicacion 7 u 8, caracterizado porque la union de los anticuerpos se detecta mediante u n ensa yo de inmunofluorescencia, M icroarray, ELISA, un ensa yo de l uminiscencia, B lot , un ensayo radioinmune, Western Blot o Dot Blot. :2C Equipo de ensayo para la deteccion de anticuerpos, caracterizado porque comprende un polipeptido segun una de las reivindicaciones 1 a 6. ::C Polipeptido segun una de las reivindicaciones 1 a 6 para su utilizacion en la terapia de celiaquia y/o dermatitis herpetiforme, caracterizado porque la s angre o el pl asma de un pa ciente s e p one en co ntacto co n un polipeptido segun una de las reivindicaciones 1 a 7, teniendo lugar la union de los anticuerpos asociados a la enfermedad, de la sangre o del plasma, al polipeptido por lo que la sangre o el plasma empobrecido en anticuerpos es adecuado para la reinfusion al paciente. ::C Composicion farmaceutica, caracterizada porque comprende un polipeptido segun una de las reivindicaciones 1 a 6. :3C Utilizacion de un polipeptido segun una de las reivindicaciones 1 a 6 para el diagnostico iº vivo de celiaquia y/o dermatitis herpetiforme. :7C Utilizacion de un polipeptido segun una de las reivindicaciones 1 a 6 para la preparacion de un medicamento para la terapia de celiaquia y/o dermatitis herpetiforme. :5C ºcido nucleico, que codifica para uno o varios polipeptidos segun una de las reivindicaciones 1 a 6.

 

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