Un método para preparar un injerto de nervio para implantación,

que comprende en cualquier orden, degradar el proteoglicano sulfato de condroitina del injerto de nervio in vitro utilizando una enzima que degrada el proteoglicano sulfato de condroitina y hacer que el injerto de nervio sea acelular.

Materiales y métodos para favorecer la reparación del tejido nervioso

Antecedentes de la invención

Las lesiones de los nervios periféricos son una fuente importante de incapacidad crónica. Un tratamiento deficiente de las lesiones de los nervios se asocia con la atrofia muscular y puede llevar a un neuroma doloroso cuando los axones cortados son incapaces de restablecer la continuidad con el nervio distal. Aunque los nervios tienen potencial para regenerarse después de una lesión, esta capacidad es estrictamente dependiente de la regeneración de las fibras nerviosas (y sus brotes axonales) que hacen un contacto apropiado con el segmento del nervio cortado (y las láminas basales de las células de Schwann en el mismo) . Los axones regenerados que no atraviesen el hueco o sitio de la lesión y entren en la lámina basal del segmento del nervio distal cortado sufrirán un deterioro, dando lugar a la muerte neuronal, atrofia muscular y déficit funcional permanente (Fawcett J W et al. [1990] Annu Rev Neurosci 13: 43-60) .

En resumen, un nervio soporta los procesos periféricos (o axones) de las neuronas. Los cuerpos neuronales residen en la médula espinal (neuronas motoras) , en los ganglios situados a lo largo de la columna vertebral (ganglios raquídeos sensoriales) o en los ganglios que se encuentran en los órganos del cuerpo (ganglios autonómicos y entéricos) . Un nervio consiste en axones, células de Schwann y vainas de tejido conjuntivo extensivo (Dagum AB [1998] J Hand Ther 11: 111-117) . La cubierta exterior, el epineurio, está hecho de tejido conjuntivo de colágeno que protege a los fascículos de la presión externa y rodea el perineurio. El perineurio rodea los fascículos individuales y, junto con las células endoteliales en los microvasos endoneurales, funciona como la barrera sangre-nervio. El endoneurio está dentro del perineurio y consiste en tejido colagenoso que rodea las células de Schwann y los axones. Un grupo fascicular consiste en dos o más fascículos rodeados, respectivamente, por el perineurio y el epineurio. La topografía de los nervios es constante distalmente, con un grupo de fascículos que son o sensoriales o motores. La neurona consiste en un soma (cuerpo) y un axón, que puede tener varios pies de largo.

En las lesiones de los nervios en las que hay rotura axonal, pero la continuidad de la vaina endoneural permanece intacta (por ejemplo, lesión por aplastamiento) , los axones se regeneran dentro de sus láminas basales originales y se puede esperar una recuperación completa. Por contraste, el rebrote axonal puede estar seriamente en peligro después del seccionamiento transversal del nervio y la reparación quirúrgica depende en gran medida del realineamiento de los elementos del nervio descritos antes (Dagum AB [1998] J Hand Ther 11: 111-117) . La coaptación epineural (neurorrafía) es el método principal de tratar el seccionamiento transversal de un nervio. Sin embargo, la extensión de la regeneración es muy variable y como mucho, se puede esperar una recuperación parcial de la función (Terzis JK et al. [1990] The Peripheral Nerve: Structure, function and reconstruction, Hampton Press, Norfolk) . La recuperación completa de la función después de la reparación del seccionamiento transversal del nervio sigue siendo un ideal inalcanzable debido a la fina microestructura de los nervios y a una incapacidad de alcanzar la coaptación precisa axón-a-axón, a pesar del estado actual de la técnica en las técnicas de microcirugía.

La implantación de injertos de nervios se asegura con la ablación del nervio pero presenta varios desafíos prácticos. A lo largo de los años, se han explorado diferentes alternativas al injerto de nervios. Actualmente se considera como una alternativa en desarrollo la aplicación de injertos de nervios alogénicos. Aunque la disponibilidad de injertos de donantes tiene las mismas dificultades que otras estrategias de sustitución de órganos, la importancia de elementos celulares viables en los injertos de nervios puede ser mucho menos importante. Aunque las células de Schwann contribuyen significativamente al proceso regenerativo, la estructura de la vaina del nervio contiene el soporte esencial y los estímulos adhesivos para promover la regeneración axonal y se ha alcanzado una regeneración significativa en los injertos de nervios acelulares (por ejemplo, desvitalizados por congelación) (Ide C et al. [1983] Brain Res 288: 61-75; Hall SM [1986] Neuropathol Appl Neurobiol 12: 401-414; Gulati AK [1988] J Neurosurg 68: 117-123; Nadim W et al. [1990] Neuropathol Appl Neurobiol 16: 411-421) . La inactivación de las células residentes que presentan antígeno (por ejemplo, las células de Schwann, los fibroblastos, las células endoteliales, etc.) reduce en gran medida la inmunogenicidad del injerto. El uso de injertos de nervios acelulares reduce grandemente o elimina los problemas de inmunorrechazo huésped-injerto (Evans PJ et al. [1994] Prog Neurobiol 43: 187-233; Evans PJ et al. [1998] Muscle Nerve 21: 15071522) . Estas características son muy prometedoras para el uso de injertos de nervios alogénicos o xenogénicos desvitalizados por congelación (acelulares) . Por otro lado, la ausencia de células viables descarta la degeneración del nervio y el subsiguiente remodelado que parece promover el proceso regenerativo (Bedi KS et al. [1992] Eur J Neurosci 4: 193-200; Danielsen N et al. [1994] Brain Res 666: 250-254) .

La laminina es un componente principal de la lámina basal, promotor del crecimiento, que representa el estímulo adhesivo para la regeneración axonal satisfactoria (Wang, GY et al. [1992] Brain Res 570: 116-125) . Sin embargo, aunque el nervio normal (no lesionado) es rico en laminina, el nervio normal permanece inhibitorio o refractario para el crecimiento axonal. (Langley JN [1904] J Physiol 31: 365-391; Brown MC et al. [1994] Eur J Neurosci 6: 420-428) . Esto da a entender que la actividad promotora del crecimiento de la laminina se suprime en el entorno de un nervio normal y que la actividad de la laminina se debe restablecer de algún modo en la degeneración del nervio y en la regeneración subsiguiente.

Los nervios periféricos normales son un pobre sustrato para el crecimiento axonal (Zuo J. et al. [1998] J Neurobiol 34: 41-54; Bedi KS et al. [1992] Eur J Neurosci 4: 193-200) . Los resultados experimentales indican que la laminina dentro de las láminas basales del nervio normal no es accesible para los brotes regenerativos de los axones (Zuo J. et al. [1998] J Neurosci 18: 5203-5211; Ferguson TA, and D. Muir [2000] Mol Cell Neurosci 16: 157-167; Agius E. et al. [1998] J Neurosci 18: 328-338) . Después de la lesión del nervio, el segmento cortado (distal a la lesión) sufre un extenso proceso degenerativo que inicia un extenso remodelado. En la degeneración del nervio inducida por la lesión, los axones cortados mueren, sus fragmentos de la vaina de mielina y los residuos resultantes se separan por fagocitosis. A pesar de esta degeneración, se conservan las estructuras de la vaina y de la lámina basal. Las células de Schwann proliferan y preparan el nervio para el nuevo crecimiento de los axones. Este proceso entero, incluyendo el aspecto del remodelado, generalmente se denomina degeneración del nervio. Queda claro ahora que la lesión del nervio produce modificaciones positivas para el segmento distal del nervio y los experimentos demuestran que el nervio degenerado tiene mayor potencial promotor del crecimiento de los axones que el nervio normal (Bedi KS et al. [1992] Eur J Neurosci 4: 193-200; Danielsen NJ et al. [1994] Brain Res 666: 250-254; Agius E et al. [1998] J Neurosci 18: 328-338) . Por lo tanto, el proceso degenerativo parece que implica mecanismos que convierten el nervio normal de un estado deprimido a un estado que promueve el crecimiento axonal (Salonen VJ et al. [1987] J Neurocytol 16: 713-720; Danielsen N et al. [1995] Brain Res 681: 105-108) .

La pérdida de la función asociada con la lesión del nervio resulta de la ruptura de los axones. Los axones son muy delgados y frágiles y la lesión más ligera (incluyendo la compresión) puede causar una respuesta grave (axotomía) . En la axotomía el axón distal a la lesión se muere y degenera. La lesión menos problemática para un nervio es una lesión por aplastamiento (axonotmesis) , en la que hay axotomía pero la continuidad de las vainas del nervio permanece intacta. En el caso de axonotmesis, los axones se regeneran típicamente sin intervención quirúrgica porque las láminas basales permanecen continuas. Para que los nervios periféricos cortados se regeneren satisfactoriamente, se deben localizar en primer lugar los brotes axonales que emanan del tronco proximal... [Seguir leyendo]

1. Un método para preparar un injerto de nervio para implantación, que comprende en cualquier orden, degradar el proteoglicano sulfato de condroitina del injerto de nervio in vitro utilizando una enzima que degrada el proteoglicano sulfato de condroitina y hacer que el injerto de nervio sea acelular.

2. El método según la reivindicación 1, en el que la degradación del proteoglicano sulfato de condroitina del injerto de nervio comprende aplicar al injerto de nervio mediante inyección o como un líquido, formulación fluida, pomada, gel, crema, o película, una enzima que degrada el proteoglicano sulfato de condroitina.

3. El método según la reivindicación 1, en el que la degradación del proteoglicano sulfato de condroitina del injerto de nervio comprende cultivar el injerto de nervio antes de hacer que el injerto de nervio sea acelular, y en el que la enzima que degrada el proteoglicano sulfato de condroitina es expresada por células del injerto de nervio.

4. El método según la reivindicación 3, en el que el cultivo tiene lugar durante un periodo de tiempo dentro del intervalo de aproximadamente 24 horas a aproximadamente 96 horas.

5. El método según la reivindicación 3, en el que el cultivo tiene lugar a una temperatura dentro del intervalo de aproximadamente 10 º C a aproximadamente 37 º C.

6. El método según cualquiera de las reivindicaciones 3 a 5, en el que la degradación del proteoglicano sulfato de condroitina del injerto de nervio comprende cultivar el injerto de nervio y aplicar al injerto de nervio mediante inyección o como un líquido, formulación fluida, pomada, gel, crema, o película, una enzima que degrada el proteoglicano sulfato de condroitina.

7. El método según la reivindicación 2 o la reivindicación 6, en el que la enzima que degrada el proteoglicano sulfato de condroitina aplicada produce la lisis de condroitina-4-sulfato, condroitina-6-sulfato, o ambos condroitina-4-sulfato y condroitina-6-sulfato dentro del injerto de nervio.

8. El método según cualquiera de las reivindicaciones 2, 6, o 7, en el que la enzima que degrada el proteoglicano sulfato de condroitina aplicada se selecciona del grupo que consiste en una condroitinasa, una hialuronidasa, una metaloproteinasa de la matriz, un fragmento o variante biológicamente activo de las mismas y las combinaciones de las mismas.

9. El método según cualquiera de las reivindicaciones 2, 6, o 7, en el que la enzima que degrada el proteoglicano sulfato de condroitina aplicada se selecciona del grupo que consiste en condroitinasa ABC, condroitinasa A, condroitinasa C, condroitinasa AC, metaloproteína-2 de la matriz, metaloproteína-9 de la matriz y las combinaciones de las mismas.

10. El método según cualquiera de las reivindicaciones precedentes, en el que el hacer que el injerto de nervio sea acelular comprende al menos un procedimiento entre la desvitalización por congelación y la extracción química con detergentes.

11. El método según cualquiera de las reivindicaciones precedentes, en el que el injerto de nervio comprende tejido nervioso periférico.

12. El método según cualquiera de las reivindicaciones precedentes, en el que el injerto de nervio comprende tejido del sistema nervioso central.

13. El método según cualquiera de las reivindicaciones precedentes, en el que el injerto de nervio comprende tejido de mamífero.

14. El método según cualquiera de las reivindicaciones precedentes, en el que el injerto de nervio es un autoinjerto.

15. El método según cualquiera de las reivindicaciones 1-13, en el que el injerto de nervio es un aloinjerto.

16. El método según cualquiera de las reivindicaciones precedentes, en el que el método comprende además congelar el injerto de nervio para conservación.

17. El método según cualquiera de las reivindicaciones precedentes, en el que el método comprende además añadir al menos una célula al injerto de nervio.

18. El método según cualquiera de las reivindicaciones precedentes, en el que el método comprende además aplicar un corte quirúrgico al injerto de nervio, en el que el corte quirúrgico facilita al menos un resultado entre proporcionar estimulación eléctrica al injerto de nervio y registrar la actividad eléctrica del nervio.

19. Un injerto de nervio obtenible por el método descrito en cualquiera de las reivindicaciones 1-18.