Marcaje de defecto de masa para la determinación de secuencias de oligómeros.

Método para secuenciar una parte terminal de un oligómero, que comprende:

(a) poner en contacto dicho oligómero con un resto de marcaje de defecto de masa para unircovalentemente el resto de marcaje de defecto de masa al extremo terminal del oligómero y formar unoligómero marcado, comprendiendo dicho resto de marcaje de defecto de masa al menos un elemento quetiene un número atómico de desde 17 hasta 77;

(b) fragmentar dicho oligómero marcado usando un método de fragmentación enzimático, quimiolítico o deespectrometría de masas para producir fragmentos de oligómero marcado; y

(c) analizar dichos fragmentos de oligómero marcado usando un método de fragmentación deespectrometría de masas para determinar la secuencia de al menos dos residuos terminales basándose enuna energía de unión nuclear de dicho al menos un elemento que confiere una masa única a dichosfragmentos de oligómero marcado.

Marcaje de defecto de masa para la determinación de secuencias de oligómeros Referencias cruzadas a solicitudes relacionadas Esta solicitud reivindica el beneficio de la solicitud de patente estadounidense provisional con n.º de serie 60/242.165, presentada el 19 de octubre de 2000, titulada “Métodos para determinar secuencias terminales de péptidos y proteínas” y de la solicitud de patente estadounidense provisional con n.º serie 60/242.98, presentada el 19 de octubre de 2000, titulada “Métodos para determinar secuencias terminales de péptidos y proteínas”, expediente del apoderado n.º 05265.P001.

Antecedentes de la invención Muchas moléculas se fragmentan por medios químicos, eléctricos (haz de electrones o colisiones inducidas por el campo con moléculas de gas neutro) u ópticos (láseres de excímero) en espectrómetros de masas de manera que las masas de los fragmentos iónicos marcados resultantes pueden usarse para identificar o reconstruir la molécula original. En otros casos, las moléculas pueden coeluirse de procedimientos de separación para distinguirse adicionalmente mediante espectrometría de masas. En algunos casos, se une un marcador a la molécula original, o moléculas específicas en una mezcla, para ayudar en la identificación de los iones o fragmentos iónicos marcados resultantes con respecto a otro ruido químico en el espectro de masas. Normalmente, este marcador consiste en elementos, o isótopos de elementos, ya contenidos en la molécula original. De esta manera, dos o más picos de abundancias relativas predeterminadas pueden encontrarse en el espectro de masas y usarse para confirmar la identidad de los fragmentos marcados. Sin embargo, cuando el marcador contiene elementos (o isótopos de estos elementos) ya contenidos en la molécula original o en otros iones generados a partir de o que contaminan de otra manera la matriz de la muestra, uno o más de los picos de fragmentos marcados puede solaparse con otros picos de iones no marcados en el espectro, confundiendo la identificación de los iones marcados.

Históricamente, se han usado de manera extensa técnicas tales como degradación de Edman para la secuenciación de proteínas. Véanse, Stark, en: Methods in Enzymology, 25:103-120 (1972) ; Niall, en: Methods in Enzymology, 27:942-1011 (1973) ; Gray, en: Methods in Enzymology, 25:121-137 (1972) ; Schroeder, en: Methods in Enzymology, 25:138-143 (1972) ; Creighton, Proteins: Structures and Molecular Principles (W. H. Freeman, NY, 1984) ; Niederwieser, en: Methods in Enzymology, 25:60-99 (1972) ; y Thiede, et al. FEBS Lett., 357:65-69 (1995) . Sin embargo, la secuenciación mediante métodos de espectrometría de masas (EM) de disociación inducida por colisión (secuenciación por EM/EM) ha evolucionado rápidamente y ha demostrado ser más rápida y requerir menos proteína que las técnicas de Edman. Véanse, Shevchenko, A., et al., Proc. Natl. Acad. Sci. (EE.UU) , 93:1444014445 (1996) ; Wilm, et al., Nature, 379:466-469 (1996) ; Mark, J., “Protein structure and identification with MS/MS”, artículo presentado en la serie de seminarios PE/Sciex, Protein Characterization and Proteomics: Automated high throughput technologies for drug discover y , Foster City, CA (marzo, 1998) ; y Bieman, Methods in Enzymology, 193:455-479 (1990) .

La secuenciación por EM se logra o bien usando voltajes superiores en la zona de ionización de la EM para fragmentar aleatoriamente un único péptido aislado a partir de una digestión de proteínas, o más normalmente mediante EM en tándem usando disociación inducida por colisión en la trampa iónica. Véase, Bieman, ibid. Pueden usarse varias técnicas para seleccionar el fragmento de péptido usado para secuenciación por EM/EM, incluyendo la acumulación del ion del fragmento de péptido original en la unidad de EM de cuadrupolo (véanse, Mark, J. ibid; Mann, M., artículo presentado en la conferencia de IBC Proteomics, Boston, MA (10-11 de noviembre de 1997) ; y Bieman, Methods in Enzymology, 193:455-479 (1990) ) , separación electroforética capilar acoplada a detección por EM ES-TOF (véanse, Aebersold, R. “Proteome analysis: Biological assay or data archive?”, artículo presentado en la conferencia de IBC Proteomics, Coronado, CA (11-12 de junio de 1998) y Smith, et al., en: CRC Handbook of Capillar y Electrophoresis: A Practical Approach, cap. 8, págs. 185-206 (CRC Press, Boca Raton, FL, 1994) ) , u otras separaciones por cromatografía de líquidos (Niall, H. D., en: Methods in Enzymology, 27:942-1011 (1973) y Creighton, T. E., Proteins: Structures and Molecular Principles (W. H. Freeman, NY, 1984) ) . La secuencia de aminoácidos del péptido se deduce a partir de las diferencias de peso molecular observadas en el patrón de fragmentación de EM resultante del péptido usando las masas publicadas asociadas con residuos de aminoácidos individuales en la EM (Biemann, K., en: Methods in Enzymology., 193:888 (1990) , y se ha codificado en un algoritmo de secuenciación de péptidos semi-autónomo (Hines, et al., J Am Soc Mass Spectrom, 3:326-336 (1992) ) .

Por ejemplo, en el espectro de masas de un péptido de 1425, 7 Da (HSDAVFTDNYTR) aislado en un experimento de EM/EM adquirido en modo de ion positivo, la diferencia entre el péptido completo de 1425, 7 Da y el siguiente fragmento de masa más grande (y11, 1288, 7 Da) es de 137 Da. Esto corresponde a la masa esperada de un residuo de histidina N-terminal que se escinde en el enlace amida. Para este péptido, la secuenciación completa es posible como resultado de la generación de iones de fragmentos de alta abundancia que corresponden a la escisión del péptido en casi cada residuo a lo largo de la estructura principal del péptido. En la secuencia de péptido mencionada anteriormente, la generación de un conjunto esencialmente completo de iones de fragmentos cargados positivamente que incluye cualquier extremo del péptido es un resultado de la basicidad de los residuos tanto Ncomo C-terminales. Cuando un residuo básico se ubica en el extremo N-terminal y/o C-terminal, la mayoría de los

iones producidos en el espectro de disociación inducida por colisión (CID) contendrán ese residuo (véanse, Zaia, J., en: Protein and Peptide Analysis by Mass Spectrometr y , J.R. Chapman, ed., págs. 29-41, Humana Press, Totowa, NJ, 1996; y Johnson, R.S., et al., Mass Spectrom. Ion Processes, 86:137-154 (1988) ) puesto que la carga positiva se ubica generalmente en el sitio básico. Normalmente, la presencia de un residuo básico simplifica el espectro resultante, puesto que un sitio básico dirige la fragmentación hacia una serie limitada de iones hijo específicos. Los péptidos que carecen de residuos básicos tienden a fragmentarse en una mezcla más compleja de iones de fragmentos que hace que la determinación de secuencia sea más difícil.

La secuenciación de ácido nucleico se ha realizado históricamente a través de la síntesis de fragmentos de ácido nucleico que contienen números aleatorios de bases copiadas de una secuencia de ácido nucleico original, tal como los métodos definidos por Sanger y Colson, Proc. Natl. Acad. Sci. (EE.UU) , 74:5463-5467 (1977) ; y Maxam y Gilbert Methods in Enzymology, 65:499-560 (1980) . Una variación en el método descrito por Sanger y Colson usa un método de la reacción en cadena de la polimerasa (PCR) incompleta para sintetizar el marcador de masa molecular de fragmentos de ADN (véase, Nakamaye et al., Nuc. Acids Res., 16 (21) :9947-9959 (1988) ) . Se han desarrollado métodos de espectrometría de masas para la identificación y separación multiplexada y más rápida de los marcadores de tamaño molecular de ADN, tal como describe Koster, patentes estadounidenses n.os 5.691.141 y 6.194.144; Monforte et al. patente estadounidense n.º 5.700.642, y Butler, et al. patente estadounidense n.º

6.090.558. En estos métodos, los fragmentos de ácido nucleico se introducen simultáneamente en el espectrómetro de masas y la secuencia o el número de “repeticiones en tándem cortas” se deducen a partir de las diferencias de masa entre elementos individuales del marcadro de masa molecular de fragmentos de masa sintetizados. Tal como se describe por Koster, patente estadounidense n.º 6.194.144, es tanto posible como deseable secuenciar varios ácidos nucleicos simultáneamente en paralelo marcando de manera diferencial los fragmentos de ácido nucleico sintetizados a partir de moldes originales de ácido nucleico únicos con diferentes etiquetas de masas suficientemente únicas. Incluso usando marcadores de masa única, debe tenerse cuidado para evitar la subfragmentación de los elementos del marcador de masa molecular de secuencias... [Seguir leyendo]

1. Método para secuenciar una parte terminal de un oligómero, que comprende:

(a) poner en contacto dicho oligómero con un resto de marcaje de defecto de masa para unir covalentemente el resto de marcaje de defecto de masa al extremo terminal del oligómero y formar un oligómero marcado, comprendiendo dicho resto de marcaje de defecto de masa al menos un elemento que tiene un número atómico de desde 17 hasta 77;

(b) fragmentar dicho oligómero marcado usando un método de fragmentación enzimático, quimiolítico o de espectrometría de masas para producir fragmentos de oligómero marcado; y

(c) analizar dichos fragmentos de oligómero marcado usando un método de fragmentación da espectrometría de masas para determinar la secuencia de al menos dos residuos terminales basándose en una energía de unión nuclear de dicho al menos un elemento que confiere una masa única a dichos fragmentos de oligómero marcado.

2. Método según la reivindicación 1, en el que dicho resto de marcaje comprende al menos un elemento de número atómico de 35 a 63.

15 3. Método según la reivindicación 2, en el que dicho resto de marcaje comprende al menos un elemento de número atómico de 39 a 58.

4. Método según la reivindicación 2, en el que dicho resto de marcaje comprende al menos un elemento seleccionado del grupo que consiste en bromo, yodo, europio e itrio.

5. Método según la reivindicación 4, en el que dicho elemento es europio.

20 6. Método según la reivindicación 4, en el que dicho elemento es itrio.

7. Método según la reivindicación 4, en el que dicho elemento es bromo.

8. Método según la reivindicación 4, en el que dicho elemento es yodo.

9. Método según la reivindicación 1, en el que dicho oligómero se selecciona del grupo que consiste en una proteína, un oligonucleótido, un oligosacárido y un lípido.

10. Método según la reivindicación 9, en el que dicho oligómero es un oligonucleótido.

11. Método según la reivindicación 9, en el que dicha secuencia es de al menos tres residuos.

12. Método según la reivindicación 9, en el que dicha secuencia es de al menos cuatro residuos.

13. Método según la reivindicación 1, en el que varios oligómeros, cada uno marcado con un número diferente de elementos de defecto de masa, se mezclan antes de dicha etapa de fragmentación o análisis.

14. Método para secuenciar una parte de un oligómero en una mezcla de oligómeros, comprendiendo dicho método:

(a) poner en contacto dicha mezcla de oligómeros con un resto de marcaje de defecto de masa para unir covalentemente el resto de marcaje de defecto de masa al extremo terminal de dicho oligómero y formar una mezcla de oligómeros marcados, comprendiendo dicho resto de defecto de masa al menos un elemento que tiene un número atómico de desde 17 hasta 77;

(b) separar oligómeros marcados individuales en dicha mezcla de oligómeros marcados; y

(c) analizar dichos oligómeros marcados individuales de la etapa (b) mediante un método de espectrometría de masas para determinar la secuencia de al menos dos residuos terminales basándose en una energía de unión nuclear de dicho al menos un elemento que confiere una masa única a dichos oligómeros marcados

individuales.

15. Método según la reivindicación 14, en el que dicho elemento tiene un número atómico de desde 35 hasta 63.

16. Método según la reivindicación 14, en el que dicho elemento tiene un número atómico de desde 39 hasta 58.

45 17. Método según la reivindicación 14, en el que dicho elemento se selecciona del grupo que consiste en bromo, yodo, europio e itrio.

18. Método según la reivindicación 14, que comprende además una etapa antes de la etapa (a) de aislar un grupo de oligómeros de una muestra biológica.

19. Método según la reivindicación 18, en el que dicha muestra biológica es de una muestra de tejido con enfermedad.

20. Método según la reivindicación 18, en el que dicha muestra biológica es de una muestra de tejido sano.

21. Método según la reivindicación 14, en el que dicha separación se realiza mediante al menos un método de electroforesis capilar de la mezcla de oligómeros marcados.

22. Método según la reivindicación 14, en el que dicho método de espectrometría de masas usa EM ESI-TOF.

23. Método para el análisis de la función y estructura de un oligómero que tiene una pluralidad de residuos, 10 comprendiendo dicho método:

(a) poner en contacto dicho oligómero con un reactivo de marcaje de defecto de masa para marcar de manera diferencial residuos expuestos y residuos no expuestos y producir un oligómero marcado de manera diferencial, en el que dicho reactivo de marcaje de defecto de masa comprende al menos un elemento que tiene un número atómico de desde 17 hasta 77; y (b) analizar dicho oligómero marcado de manera diferencial mediante un método de espectrometría de masas para determinar secuencias de dicho oligómero que están expuestas en la estructura tridimensional y secuencias de dicho oligómero que no están expuestas en la estructura tridimensional basándose en una energía de unión nuclear de dicho al menos un elemento que confiere una masa única a dicho oligómero marcado de manera diferencial.

24. Método según la reivindicación 23, en el que dicho oligómero es una proteína, un ácido nucleico o un oligosacárido.

25. Método según la reivindicación 23, en el que dicho reactivo de marcaje de defecto de masa comprende al menos un elemento de número atómico de 35 a 63.

26. Método según la reivindicación 23, en el que dicho reactivo de marcaje de defecto de masa es bromo y 25 dicho oligómero es una proteína.

27. Método según la reivindicación 23, en el que dicho reactivo de marcaje de defecto de masa comprende al menos un elemento de número atómico de 39 a 58.

28. Método según la reivindicación 23, en el que dicho oligómero marcado de manera diferencial se fragmenta mediante métodos quimiolíticos o enzimáticos antes de la etapa (b) .

29. Método según la reivindicación 23, en el que dicho oligómero es una proteína, dicho defecto de masa es bromo o yodo y dichos residuos expuestos comprenden una parte de los residuos de tirosina presentes en dicha proteína.

30. Método según la reivindicación 23, en el que dicho método de espectrometría de masas usa EM ESI-TOF.

31. Método según la reivindicación 29, en el que dicho método de espectrometría de masas usa EM ESI-TOF.

32. Método para secuenciar la parte terminal de un oligómero, que comprende:

(a) poner en contacto una primera muestra de dicho oligómero con un resto de marcaje de defecto de masa para unir covalentemente el resto de marcaje de defecto de masa al extremo terminal del oligómero y formar un oligómero marcado, teniendo dicho resto de marcaje de defecto de masa un elemento con un número atómico de desde 17 hasta 77;

(b) poner en contacto una segunda muestra de dicho oligómero con un resto de marcaje de defecto de masa para unir covalentemente el resto de marcaje de defecto de masa al extremo terminal del oligómero y formar un oligómero marcado, teniendo dicho resto de marcaje de defecto de masa dos elementos con un número atómico de desde 17 hasta 77;

(c) opcionalmente, repetir la etapa (b) desde una hasta tres veces con muestras adicionales, en el que los 45 restos de marcaje de defecto de masa tienen tres, cuatro o cinco elementos, respectivamente, con un número atómico de desde 17 hasta 77;

(d) mezclar los oligómeros marcados de las etapas (a) a la (c) ;

(e) fragmentar dichos oligómeros marcados usando un método de fragmentación enzimático, quimiolítico o de espectrometría de masas para producir fragmentos de oligómero marcado; y

(f) analizar dichos fragmentos de oligómero marcado usando un método de fragmentación de espectrometría de masas para determinar la secuencia de al menos dos residuos terminales basándose en una energía de unión nuclear de dicho un elemento, dichos dos elementos, o dichos tres, cuatro o cinco elementos que confieren una masa única a dichos fragmentos de oligómero marcado.

33. Método según la reivindicación 32, en el que cada uno de dichos elementos tiene un número atómico de desde 35 hasta 63.

34. Método según la reivindicación 32, en el que cada uno de dichos elementos tiene un número atómico de desde 39 hasta 58.

35. Método según la reivindicación 32, en el que cada uno de dichos elementos se selecciona del grupo que 10 consiste en bromo, yodo, europio e itrio y dicho oligómero es una proteína.

36. Método según la reivindicación 32, en el que cada uno de dichos elementos se selecciona del grupo que consiste en bromo, yodo, europio e itrio y dicho oligómero es un oligonucleótido.

37. Método según la reivindicación 32, en el que cada uno de dichos elementos se selecciona del grupo que consiste en bromo, yodo, europio e itrio y dicho oligómero es un oligosacárido.

38. Método para secuenciar una parte de un oligómero, que comprende:

a) fragmentar alícuotas de dicho oligómero usando uno o más métodos de fragmentación quimiolíticos o enzimáticos específicos para producir fragmentos de oligómero, en el que se aplica un método de fragmentación diferente a cada alícuota;

(b) poner en contacto una primera alícuota de fragmentos de oligómero con un primer resto de marcaje de defecto de masa para unir covalentemente dicho primer resto de marcaje de defecto de masa al extremo terminal de los fragmentos de oligómero y formar fragmentos de oligómero marcado, teniendo dicho primer resto de marcaje de defecto de masa un elemento con un número atómico de desde 17 hasta 77;

(c) opcionalmente poner en contacto las otras alícuotas de fragmentos de oligómero con otros restos de marcaje de defecto de masa distintos para unir covalentemente dichos restos de marcaje de defecto de masa distintos a los extremos terminales de los fragmentos de oligómero y formar fragmentos de oligómero marcado, teniendo dicho resto de marcaje de defecto de masa distinto dos o más elementos con un número atómico de desde 17 hasta 77;

(d) opcionalmente mezclar las alícuotas de fragmentos de oligómero marcado; y

(e) analizar dichos fragmentos de oligómero marcado usando un método de fragmentación da espectrometría de masas para determinar la secuencia de al menos dos residuos de dicho oligómero basándose en una energía de unión nuclear de dicho un elemento o dichos dos o más elementos que confieren una masa única a dichos fragmentos de oligómero marcado.

39. Método según la reivindicación 38, en el que dicho oligómero es un lípido.

40. Método según la reivindicación 38, en el que dicho oligómero es una proteína.

41. Método según la reivindicación 38, en el que dicho oligómero es un ácido nucleico.

42. Método según la reivindicación 38, en el que dicho oligómero es un oligosacárido.

43. Método según la reivindicación 38, en el que dichos elementos tienen un número atómico de desde 35 hasta 63.

44. Método según la reivindicación 43, en el que dichos elementos tienen un número atómico de desde 39 40 hasta 58.

45. Método para comparar las abundancias relativas de analitos a partir de dos o más muestras, que comprende:

(a) poner en contacto los analitos de la primera muestra con un resto de marcaje de defecto de masa para unir covalentemente el resto de marcaje de defecto de masa a los analitos y formar analitos marcados, 45 teniendo dicho resto de marcaje de defecto de masa un elemento con un número atómico de desde 17 hasta 77;

(b) poner en contacto los analitos de muestras posteriores con restos de marcaje de defecto de masa para unir covalentemente los restos de marcaje de defecto de masa a los analitos en cada muestra, en el que los restos de marcaje de defecto de masa usados para cada muestra posterior contienen un elemento adicional 50 con un número atómico de desde 17 hasta 77;

(c) mezclar las alícuotas de analitos marcados; y (d) analizar dichos fragmentos de oligómero marcado usando un método de fragmentación de espectrometría de masas para determinar las abundancias relativas de uno o más de los analitos entre las muestras basándose en una energía de unión nuclear de dicho un elemento o dichos elementos 5 adicionales que confieren una masa única a dichos fragmentos de oligómero marcado.

46. Método según la reivindicación 45, en el que dichos elementos tienen un número atómico de desde 35 hasta 63.

47. Método según la reivindicación 45, en el que dichos elementos tienen un número atómico de desde 39 hasta 58.

48. Método según la reivindicación 45, en el que al menos una parte de dicho resto de marcaje de la etapa (a) es un isótopo estable de dicho resto de marcaje de la etapa (b) .