Matriz de MALDI y procedimiento de MALDI.

Un procedimiento de espectrometría de masas MALDI para analizar un analito en aerosol que comprende:

- aplicar un alcohol en una concentración para lograr una presión de vapor al menos parcialmente saturadaen un intervalo de temperatura de 15 - 100°C.

- sublimar el material de matriz para la espectrometría de masas MALDI que comprende 2-mercapto-4,5-dialquilheteroareno de conformidad con la fórmula (I)

donde X es N, S u O y donde R1 y R2 se seleccionan independientemente de hidrógeno, metilo, metoxi, etoxi ypropoxi o donde R1 y R2 se unen para formar una estructura de anillo aromático opcionalmente sustituido, quecomprende opcionalmente uno o más heteroátomos, o una forma tautomérica de este en presencia de alcohol,

- poner el analito de aerosol en contacto con el material de matriz en la fase gaseosa

- ionizar al menos parte de dicho analito; y

- separar los componentes ionizados utilizando un espectrómetro de masas, por ejemplo, un espectrómetrode masas en tiempo de vuelo.

Matriz de MALDI y procedimiento de MALDI.

La invención se refiere a un procedimiento de espectrometría de masas MALDI en aerosol, al uso de un compuesto específico como un material de matriz MALDI en aerosol y al uso de una composición de matriz MALDI en un procedimiento de revestimiento en la fase gaseosa.

La introducción de la desorción/ionización láser asistida por matriz (MALDI) como una técnica de ionización suave en la espectrometría de masas (MS) ha revolucionado el análisis de una gran variedad de compuestos de masa alta, que incluyen polímeros bioquímicamente importantes. MALDI es un procedimiento que permite la producción de iones intactos en fase gaseosa a partir de compuestos térmicamente lábiles y no volátiles como proteínas, péptidos, oligonucleótidos, oligosacáridos, y polímeros sintéticos, con un peso molecular de entre 400 y 350 000 Da. De conformidad con el procedimiento MALDI MS, se utiliza una matriz para proteger la molécula lábil del analito de ser destruida directamente por el rayo láser.

La técnica de ionización suave de MALDI MS permite generalmente el análisis de biomoléculas. MALDI MS se utiliza por ejemplo en el análisis y la clasificación de (fracciones de) microorganismos.

Un análisis MALDI MS comprende dos etapas. La primera etapa involucra la preparación de una muestra mediante la mezcla del analito con un exceso molar de un material de matriz. La segunda etapa del proceso MALDI implica la desorción de porciones volumétricas de la muestra sólida mediante pulsos cortos intensos de láser. Se considera que la matriz cumple tres objetivos: el aislamiento de los analitos entre sí, la absorción de energía del láser para desorber los analitos y la promoción de la ionización. La luz láser genera la ionización de una pequeña fracción de la matriz y la muestra de analitos. Las masas moleculares de los iones en fase gaseosa resultantes se determinan generalmente mediante la aceleración de las moléculas ionizadas en un campo eléctrico y la separación de las moléculas en base a su masa en un detector de tiempo de vuelo (TOF) . MALDI-TOF es un procedimiento sensible que permite la detección de cantidades muy pequeñas de un componente.

El material de matriz aplicado suele ser un ácido orgánico pequeño. Los materiales de matriz comúnmente utilizados incluyen ácido 3, 5-dimetoxi-4-hidroxicinámico (ácido sinapínico) , ácido a-ciano-4-hidroxicinámico (a-ciano o a-matriz) y ácido 2, 5-dihidroxibenzoico (DHB) . Generalmente, el material de matriz se disuelve en una mezcla con agua altamente purificada y otro compuesto orgánico (normalmente, acetonitrilo (ACN) ) . Normalmente, se agrega también un ácido, como ácido trifluoroacético (TFA) , dado que el ácido puede suprimir la influencia perturbadora de impurezas salinas en el espectro de masas del analito. Asimismo, la disminución del pH de la solución de matriz suele resultar en una mayor calidad de la muestra, como un mayor número e intensidad de señales.

Posteriormente, la solución de matriz se mezcla con el analito que se desea investigar. El compuesto orgánico (por ejemplo, ACN) permite la disolución de las proteínas hidrófobas en la muestra, mientras que el agua permite la disolución de proteínas hidrófilas. En un procedimiento MALDI convencional, esta solución se coloca en una placa MALDI (generalmente, una placa de metal diseñada para dicho fin) . Los disolventes se evaporan, dejando únicamente la matriz recristalizada, que tiene las proteínas de analito diseminadas en los cristales de matriz.

Generalmente, en la espectrometría de masas MALDI en aerosol, el desarrollo sigue dos líneas de tratamiento de muestras, ya sea con una matriz que premezcla analitos previo a la aerosolización o con un revestimiento de vuelo en tiempo real de las partículas de aerosol. El revestimiento de la matriz en vuelo permite la espectrometría de masas MALDI en aerosol en línea del bioaerosol atmosférico.

En el caso de MALDI de partículas únicas en aerosol en tiempo real, los aerosoles deben revestirse con material de matriz en la fase gaseosa. Por lo tanto, el material de matriz debería ser suficientemente volátil. Asimismo, una cantidad suficiente de material de matriz debería depositarse en los aerosoles. Se ha intentado en la técnica previa realizar un análisis MALDI en aerosoles, particularmente en bioaerosoles.

En WO-A-02/052246, por ejemplo, se describe un procedimiento MALDI MS en aerosoles, donde los aerosoles se proporcionan con una matriz MALDI mediante evaporación/condensación o sublimación/condensación. De conformidad con la presente, los aerosoles secados revestidos con la matriz MALDI pueden ionizarse con un láser pulsado. Por lo tanto, los componentes ionizados pueden analizarse mediante TOF MS.

La tesis de doctorado de A.L. van Wuijckhuijse “Aerosol Time-of-Flight Mass Spectrometr y : An approach to detect, select and identify biological aerosols” (2003) también divulga los procedimientos MALDI MS para analitos en aerosol.

Para analizar los microorganismos que están comprendidos en bioaerosoles, se deberían analizar las proteínas características para la especie bacteriana o aún para la cepa bacteriana o aún para una forma de desarrollo particular. Sin embargo, la mayoría de las proteínas características (como las proteínas ribosomales en el rango de masa molecular de 1-20 kDa) están protegidas por la membrana celular, y por ende, no están disponibles para la ionización. Los bioaerosoles suelen necesitar un tratamiento en línea que permite que las proteínas estén disponibles para la ionización, por ejemplo, mediante degradación parcial de la membrana celular previo a la ionización. De manera clásica, con MALDI convencional, dicho tratamiento comprende la solución de un ácido y el material de matriz MALDI en agua y acetonitrilo, seguido de la incorporación del analito de microorganismo y el posterior secado de la mezcla. El ácido degrada parcialmente la membrana celular, haciendo que las proteínas características estén disponibles para la ionización. Los parámetros importantes en este procedimiento son la relación de matriz y ácido con el analito y la forma de cristal de la matriz después del secado.

Queda claro que el procedimiento previamente mencionado no es adecuado para el muestreo y el análisis en tiempo real, dado que la preparación del analito implica muchas etapas y mucho tiempo. Asimismo, los inventores reconocieron que el uso de las condiciones acídicas combinadas con altas temperaturas (> 80 0C) , necesarias para la evaporación de matriz, tiene un efecto negativo en la respuesta de detección MS de las partículas de proteína en la fase gaseosa. Por otra parte, el material de matriz se degrada más rápidamente en presencia de un ácido o condiciones acídicas acuosas.

Un diseño de la espectrometría de masas MADI convencional tiene un alto rendimiento y por lo tanto, es adecuado, por ejemplo, para la identificación de bacterias a nivel de cepa. Sin embargo, el rendimiento de MALDI MS en aerosol en línea no es satisfactorio aún, particularmente, el rendimiento de MALDI MS en bioaerosol en línea de proteínas en el rango de masa molecular de 1-20 kDa.

El revestimiento de bioaerosoles como aerosoles que comprenden microorganismos y/o proteínas, con un material de matriz MALDI adecuado permite una caracterización en línea de los bioaerosoles, que incluyen el material biológico. Los aerosoles pueden revestirse con un material de matriz mediante la condensación del material de matriz en los aerosoles de la fase gaseosa como se describe en WO-A-02/052246. Sin embargo, este procedimiento no es adecuado para la mayoría de los materiales de matriz disponibles, dado que no son muy volátiles y/o térmicamente estables a presión atmosférica. Asimismo, algunos materiales de matriz volátiles conocidos como alcohol de 3-nitrobencilo y ácido picolínico tienen una calidad de señal no satisfactoria. Existe una fuerte necesidad de materiales de matriz MALDI adecuados. Asimismo, existe una gran necesidad de un procedimiento mejorado para proporcionar aerosol con un revestimiento de material de matriz MALDI adecuado en la fase gaseosa, preferentemente a presión atmosférica. Sigue siendo un desafío proporcionar un microorganismo en fase gaseosa que contenga aerosoles con una cantidad suficiente de material de matriz para generar una alta respuesta de proteínas características, en particular aquellas dentro del intervalo de 1-20 kDa.

El objeto de la invención es satisfacer la necesidad de materiales de matriz y las técnicas de preparación en tiempo real/directa, es decir, sin recolección previa de bioaerosol, espectrometría de masas MALDI en aerosol con una... [Seguir leyendo]

1. Un procedimiento de espectrometría de masas MALDI para analizar un analito en aerosol que comprende:

aplicar un alcohol en una concentración para lograr una presión de vapor al menos parcialmente saturada en un intervalo de temperatura de 15 – 100°C.

sublimar el material de matriz para la espectrometría de masas MALDI que comprende 2mercapto-4, 5-dialquilheteroareno de conformidad con la fórmula (I)

donde X es N, S u O y donde R1 y R2 se seleccionan independientemente de hidrógeno, metilo, metoxi, etoxi y propoxi o donde R1 y R2 se unen para formar una estructura de anillo aromático opcionalmente sustituido, que comprende opcionalmente uno o más heteroátomos, o una forma tautomérica de este en presencia de alcohol,

poner el analito de aerosol en contacto con el material de matriz en la fase gaseosa ionizar al menos parte de dicho analito; y

separar los componentes ionizados utilizando un espectrómetro de masas, por ejemplo, un espectrómetro de masas en tiempo de vuelo.

2. Un procedimiento de conformidad con la reivindicación 1, donde R1 y R2 son iguales.

3. Un procedimiento de conformidad con la reivindicación 1 o 2 donde R1 y R2 son grupos metilo.

4. Un procedimiento de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones anteriores, donde X es S.

5. Un procedimiento de conformidad con la reivindicación 1, donde el alcohol se selecciona del grupo que consiste de metanol, etanol, propanol, isopropanol, n-butanol, sec-butanol, isobutanol y terc-butanol.

6. Un procedimiento de conformidad con la reivindicación 1, donde el alcohol es un alcohol polihídrico, como un diol o un triol.

7. Un procedimiento de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 6, donde dicho alcohol es halogenado, como clorado o fluorado.

8. Un procedimiento de conformidad con las reivindicaciones 1 a 7, donde al menos un átomo de º-carbono del alcohol se sustituye con al menos un átomo de halógeno.

9. Un procedimiento de conformidad con las reivindicaciones 1 a 8, donde dicho alcohol está totalmente halogenado.

10. Un procedimiento de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 9, donde dicho aerosol tiene una granulometría media como se mide por microscopía electrónica de transmisión de al menos 0, 1 !m, preferentemente 0, 3-20 !m y más preferentemente 0, 5-15 !m.

11. Un procedimiento de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 10, donde dicho analito comprende material biológico, preferentemente microorganismos y/o proteínas.

12. Un procedimiento de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 11, donde dicho analito ha sido sometido a una selección de granulometría antes de entrar en contacto con dicho material de matriz.

13. Un procedimiento para clasificar biomateriales que comprende:

obtener un espectro de masas MALDI de biomateriales diferentes mediante el uso de un procedimiento de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 12; comparar el espectro MALDI MS obtenido con una bibliografía de espectros MALDI MS; y en base a dicha comparación clasificar dicho biomaterial.

14. El procedimiento de espectrometría de masas MALDI para analizar un analito que comprende: aplicar un alcohol en una concentración para lograr una presión de vapor al menos parcialmente saturada

en un intervalo de temperatura de 15 a 100°C, sublimar un material de matriz que comprende 2-mercapto-4, 5-dimetiltiazol en presencia del alcohol, poner en contacto el analito con el material de matriz; ionizar al menos parte de dicho analito; y separar los componentes ionizados utilizando un detector de tiempo de vuelo.

15. El uso de 2-mercapto-4, 5-dimetiltiazol como un material de matriz para la espectrometría de masas MALDI, que se sublima en presencia de un alcohol.

16. El uso de una composición de matriz que comprende un 2-mercapto-4, 5-dialquilheteroareno de conformidad con la fórmula (I)

donde X es N, S u O y donde R1 y R2 se seleccionan independientemente de hidrógeno, metilo, metoxi, etoxi y propoxi o donde R1 y R2 se unen para formar una estructura de anillo aromático opcionalmente sustituido, que comprende opcionalmente uno o más heteroátomos, o una forma tautomérica de este,

sublimados en presencia de un alcohol,

en un procedimiento de revestimiento de la matriz en fase gaseosa para la espectrometría de masas MALDI.

17. El uso de conformidad con la reivindicación 15 o 16, donde el alcohol se elige del grupo que consiste de metanol, etanol, propanol, isopropanol, n-butanol, sec-butanol, isobutanol, y terc-butanol.

18. El uso de conformidad con la reivindicación 16, donde el alcohol es un alcohol halogenado.