MAMÍFERO NO HUMANO MODIFICADO GENÉTICAMENTE, CÉLULAS Y MÉTODOS PARA PRODUCIRLAS.

Mamífero no humano modificado genéticamente, células y métodos para producirlas. La presente invención se encuentra dentro del campo de la biología molecular y la biotecnología, y se refiere a un mamífero no humano modificado genéticamente cuyas células comprenden una secuencia nucleotídica inactivada funcionalmente o que ha sido suprimida total o parcialmente, donde dicha secuencia corresponde a un gen que codifica para la proteína TC21 (RRas2 o R-Ras2). Asimismo, la invención también se refiere a una célula aislada, procedente de un mamífero, modificada genéticamente para que presente la modificación genética descrita, así como a los métodos para producir tanto los animales como las células modificadas genéticamente y al uso de dichas células y métodos que las comprenden para el cribado y selección de compuestos con capacidad moduladora de la supervivencia y homeostasis de las células B y T. Por otra parte, la presente invención se refiere a una secuencia nucleotídica capaz de generar un siRNA para la silenciación post-transcripcional del producto de expresión de la citada proteína TC21. Estado de la técnica anterior En ausencia de antígenos, el número de linfocitos periféricos T y B es constante gracias a mecanismos homeostáticos estrictos, que evitan su proliferación descontrolada y por tanto el desarrollo de linfomas (Seddon y Zamoyska. 2003. Curr Opin Immunol, 15: 321-324). Estos mecanismos garantizan también la disponibilidad de poblaciones de células clónicas, cuya proliferación específica en respuesta a patógenos se regula mediante señales transmitidas por interleuquinas y por factores de crecimiento, señales que difieren para las células T y B, y para los linfocitos vírgenes (naive) respecto a los linfocitos de memoria. En el control de la proliferación de las células T y B, tanto en homeostasis como en respuesta a antígeno, tienen gran relevancia sus respectivos receptores de antígeno (TCR y BCR). En las células T ß, TCR está compuesto por las subunidades de unión a ligando TCR y TCRß y por las subunidades de señalización CD3, CD3, CD3 y CD3. El TCR estimula el paso de la fase G0 a G1 del ciclo celular de los linfocitos T, quienes, bajo el estímulo de las citoquinas producidas en respuesta a la unión de antígeno (principalmente la IL-2) progresan en dicho ciclo, resultando en una expansión clonal de los linfocitos que responden a un antígeno dado. Por otra parte, en ausencia del TCR, la supervivencia de los linfocitos T maduros es muy limitada, probablemente porque necesitan de las señales de baja intensidad que este receptor produce constantemente en respuesta a la unión del complejo de histocompatibilidad principal (MHC) a péptidos no antigénicos. De manera similar, la ausencia del receptor de antígenos de las células B (BCR) limita mucho la supervivencia de las células B maduras (Lam et al. 1997. Cell, 90: 1073-1083). Aunque sigue sin estar claro cómo TCR y BCR transducen las señales de supervivencia y homeostáticas, un mediador importante en esta transducción es la fosfoinositidil-3-quinasa (PI3K), cuya activación está directamente ligada a la recepción del antígeno por los receptores TCR y BCR. Consecuentemente, la inactivación de la subunidad p110 reduce significativamente el número de células B y T periféricas (Okkenhaug et al. 2007. Trends Immuno. 28: 80-87). Esta subunidad es activada selectivamente por las proteínas R-Ras y R-Ras2 (también denominada TC21), que pertenecen a la familia de proteínas Ras. Las proteínas Ras son moléculas que regulan el ciclo celular por medio de las conformaciones de su unión a GTP (forma activa) y su unión a GDP (forma inactiva). En línea con el papel clave de TC21 en la regulación de la proliferación de las células, se ha encontrado que el cáncer de ovario y el leiomiosarcoma presentan ciertas mutaciones que resultan en la activación de TC21. También se ha comprobado que su sobre-expresión está ligada a tumores de mama, esófago y estómago (Chan et al. 1994. Proc Natl Acad Sci U S A, 91: 7558-7562; Huang et al. 1995. Oncogene, 11: 1255-1260; Clark et al. 1996. Oncogene, 12: 169-176). En linfocitos no se conocen las vías de transmisión de señales en las que interviene TC21. Por tanto, sería importante el uso de determinadas células procedentes de un organismo modificado genéticamente o células modificadas directamente, para facilitar la selección de compuestos capaces de modular la homeostasis de las células B y T y, como consecuencia, para el tratamiento de enfermedades cancerosas relacionadas con dichos linfocitos B y T. Explicación de la invención La presente invención se encuentra dentro del campo de la biología molecular y la biotecnología, y se refiere a un mamífero no humano modificado genéticamente cuyas células comprenden una secuencia nucleotídica inactivada funcionalmente o delecionada (que ha sido suprimida) total o parcialmente donde dicha secuencia corresponde a un gen que codifica para la proteína TC21 (RRas2 o R-Ras2). Asimismo, la invención también se refiere a una célula aislada, procedente de un mamífero, modificada genéticamente que presenta la modificación genética descrita así como a los métodos para producir tanto los animales como las células modificadas genéticamente y al uso de dichas células y métodos que las comprenden para el screening de compuestos con capacidad moduladora de la supervivencia y homeostasis de las células B y T. Por otra parte la presente invención se refiere a una secuencia nucleotídica capaz de generar un siRNA para la silenciación post-transcripcional del producto de expresión de la citada proteína TC21. Los receptores de los antígenos celulares T y B (TCR y BCR) transmiten señales de baja intensidad necesarias para la supervivencia y el mantenimiento de las poblaciones de células maduras. Los autores demuestran aquí que el TC21, una GTPasa de pequeño tamaño, interactúa constitutivamente con los TCR y BCR a través de los motivos 2 ES 2 351 646 A1 de activación basados en tirosina asociados a inmunoreceptores (ITAM) que se encuentran en sus subunidades CD3. La expresión tanto de un mutante TC21 dominante-negativo o de una construcción shRNA en células T provoca una rápida disminución de la viabilidad celular. De forma más importante, los ratones TC21-/- tienen pocas células T y B maduras, posiblemente como resultado de una proliferación homeostática deficiente y una supervivencia defectuosa. Los autores demuestran que TC21 se sobreexpresa en varios cánceres linfáticos y que se asocia con un ITAM vírico, sugiriendo que la desregulación de la actividad de TC21 o de su distribución contribuye a la formación de linfomas. La transfección de células T tanto con un mutante TC21 dominante negativo o con una construcción shRNA lleva a una pérdida rápida de viabilidad celular, indicando que TC21 tiene un papel no redundante en la supervivencia de la célula T. Además, cuando el gen TC21 se ha inactivado en ratones, se detectan pocas células B y T periféricas, aunque éstas se desarrollan con normalidad. Los ganglios linfáticos de los ratones deficientes en TC21 aparecen minorados en los centros germinales, y las células B de zona marginal (ZM) están virtualmente ausentes. Estos resultados sugieren que TC21 se une directamente a TCR y BCR en los que cumple un papel esencial en la supervivencia mediada por el receptor antigénico y en la señalización homeostática. Además, la asociación directa de TC21 con los ITAM víricos y no víricos (por ejemplo, los de TCR y BCR) no fosforilados sugiere un papel para TC21 en la señalización de baja intensidad del receptor antigénico, así como en la transformación de los linfocitos. Un aspecto de la presente invención es una célula aislada procedente de un mamífero modificada genéticamente, que comprende una secuencia nucleotídica que tiene al menos un 80% de identidad con una secuencia que codifica para SEQ ID NO: 1, inactivada funcionalmente o delecionada total o parcialmente, en homocigosis o heterocigosis. La secuencia nucleotídica que tiene al menos un 80% de identidad con una secuencia que codifica para SEQ ID NO: 1 puede ser, pero sin limitarse, una secuencia de ADN genómico, secuencia que contiene exones e intrones. La secuencia SEQ ID NO: 1 es la secuencia codificante (ADNc; secuencia que contiene sólo los exones) del gen RRas2 de Mus musculus (ratón). Tras el procesado (splicing) del ARN mensajero (ARNm) transcrito en la célula a partir de la citada secuencia de ADN genómico o a partir de la secuencia de ADNc SEQ ID NO: 1, se da lugar a una proteína idéntica partiendo de cualquiera de las dos secuencias. Las proteínas, producto de la expresión de la secuencia nucleotídica que tiene al menos un 80% de identidad con una secuencia que codifica para SEQ ID NO: 1, tienen una identidad superior al 80%... [Seguir leyendo]

1. Célula aislada procedente de un mamífero no humano, modificada genéticamente, que comprende al menos una mutación insercional en una secuencia nucleotídica que tiene al menos un 80% de identidad con una secuencia que codifica para SEQ ID NO: 1, donde dicha secuencia nucleotídica está inactivada. 2. Célula según la reivindicación 1, donde la mutación insercional se produce en el primer intrón de dicha secuencia nucleotídica. 3. Célula aislada procedente de un mamífero no humano, modificada genéticamente, que comprende el producto de expresión de una secuencia nucleotídica que tiene al menos un 80% de identidad con una secuencia que codifica para SEQ ID NO: 1, donde dicho producto de expresión está inactivado mediante un siRNA codificado por una secuencia que comprende la secuencia SEQ ID NO: 3 o la secuencia SEQ ID NO: 4. 4. Célula según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, donde la secuencia nucleotídica que tiene al menos un 80% de identidad con una secuencia que codifica para SEQ ID NO:1 es la propia SEQ ID NO: 1. 5. Célula según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4, donde dicha célula es somática o germinal. 6. Célula según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5, donde la célula es una célula madre. 7. Célula según la reivindicación 6, donde la célula madre se selecciona de la lista que comprende pluripotente, multipotente o unipotente. 8. Célula según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 7, donde dicho mamífero no humano es Mus musculus (ratón). 9. Célula según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 8, donde la célula se selecciona de la lista que comprende oocito, blastómero, blastocito o célula embrionaria. 10. Mamífero no humano modificado genéticamente que contiene la célula según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 9. 11. Mamífero no humano modificado genéticamente según la reivindicación 10, donde dicho mamífero es un ratón. 12. Uso de la célula modificada genéticamente según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 9 para el screening de compuestos con capacidad moduladora de la homeostasis de células B y/o de células T. 13. Método para la producción de la célula modificada genéticamente según cualquiera de las reivindicaciones 1, 2, y 4 a 9 que comprende: a) Obtener al menos una célula aislada procedente de un mamífero no humano, b) transfectar la célula del apartado (a) con un vector retroviral, capaz de insertar una secuencia nucleotídica en cualquier posición nucleotídica de una secuencia que tiene al menos un 80% de identidad con una secuencia que codifica para SEQ ID NO: 1, y c) seleccionar la célula en la que la función de la secuencia con al menos un 80% de identidad con una secuencia que codifica para SEQ ID NO: 1 queda inactivada, en homocigosis o heterocigosis. 14. Método para la producción de la célula modificada genéticamente según la reivindicación 3 que comprende: a) Obtener al menos una célula aislada procedente de un mamífero no humano, b) transfectar la célula del apartado (a) con un siRNA codificado por una secuencia que comprende la secuencia SEQ ID NO: 3 o la secuencia SEQ ID NO: 4, y c) seleccionar la célula en la que el producto de expresión de una secuencia nucleotídica que tiene al menos un 80% de identidad con la secuencia que codifica para SEQ ID NO: 1, queda inactivada. 15. Método para la producción de un mamífero no humano modificado genéticamente según cualquiera de las reivindicaciones 10 u 11 que comprende: a) Incorporar la célula madre según cualquiera de las reivindicaciones 6 ó 7 a un embrión, b) introducir el embrión del apartado (a) en un órgano sexual de un individuo hembra en condiciones donde dicho individuo sea capaz de desarrollar progenie, e 17 ES 2 351 646 A1 c) identificar al menos un descendiente de la progenie del apartado (b) que contiene la secuencia nucleotídica que tiene al menos un 80% de identidad con una secuencia que codifica para SEQ ID NO: 1 inactivada, en homocigosis o heterocigosis. 16. Método para la producción del mamífero no humano modificado genéticamente según la reivindicación 15, donde el embrión del apartado (a) es un oocito fecundado, mórula o blastocisto. 17. Método para la producción del mamífero no humano modificado genéticamente según cualquiera de las reivindicaciones 15 ó 16 donde la incorporación de la célula madre del apartado (a) contribuye a todos los linajes celulares de dicho embrión. 18. Método para la producción del mamífero no humano modificado genéticamente según cualquiera de las reivindicaciones 15 a 17, donde la secuencia nucleotídica que tiene al menos un 80% de identidad con una secuencia que codifica para SEQ ID NO: 1 es SEQ ID NO: 1. 19. Método para la producción del mamífero no humano modificado genéticamente según cualquiera de las reivindicaciones 15 a 18, que además comprende cruzar un descendiente identificado en el apartado (c) para producir mamíferos no humanos heterocigóticos en la modificación genética introducida. 20. Método para la producción del mamífero no humano modificado genéticamente según la reivindicación 19, que además comprende cruzar dos descendientes heterocigóticos para producir al menos un descendiente homocigótico en la modificación genética introducida. 21. Método para el screening de compuestos con capacidad moduladora de la homeostasis de células B y/o de las células T que comprende: a) Cultivar al menos una célula modificada genéticamente según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 9 en un medio de cultivo, b) administrar un compuesto a la célula del apartado (a), o a dicho medio de cultivo, para generar al menos una célula tratada, c) medir la capacidad moduladora de la homeostasis de las células B y/o de las células T en la célula tratada del apartado (b), y d) comparar dicha capacidad moduladora del apartado (c) con la capacidad moduladora de la homeostasis de las células B y T que produce el compuesto del apartado (b) en células control. 22. Uso de una secuencia nucleotídica, que comprende una mutación insercional, que tiene al menos un 80% de identidad con una secuencia que codifica para SEQ ID NO: 1, o con SEQ ID NO: 1, donde dicha secuencia nucleotídica está inactivada, como diana, en una célula de mamífero no humano aislada, para el screening de compuestos con capacidad moduladora de la homeostasis de células B y/o células T. 23. Uso según la reivindicación 22 donde las células de mamífero son de ratón. 24. Compuesto con capacidad moduladora de la homeostasis de células B y/o células T obtenido por el método según la reivindicación 21, donde dicho compuesto es una secuencia nucleotídica que comprende SEQ ID NO: 3 o SEQ ID NO: 4 que codifica para un siRNA de una secuencia nucleotídica que tiene al menos un 80% de identidad con SEQ ID NO: 1, o que es SEQ ID NO: 1. 25. Vector de expresión que comprende el compuesto con capacidad moduladora de la homeostasis de células B y/o células T según la reivindicación 24. 26. Célula modificada genéticamente, aislada de un mamífero no humano, transfectada con el vector según la reivindicación 25. 27. Compuesto con capacidad moduladora de la homeostasis de células B y/o células T según la reivindicación 24, o del vector según la reivindicación 25 para su uso en el tratamiento o prevención de un cáncer hematopoyético. 28. Compuesto con capacidad moduladora de la homeostasis de células B y/o células T según la reivindicación 27, donde el cáncer hematopoyético es un linfoma. 29. Uso del compuesto con capacidad moduladora de la homeostasis de células B y/o células T según la reivindicación 24, o del vector según la reivindicación 25 para la elaboración de un medicamento destinado al tratamiento o prevención de un cáncer hematopoyético. 30. Uso del compuesto con capacidad moduladora de la homeostasis de células B y/o células T según la reivindicación 29, donde el cáncer hematopoyético es un linfoma. 18 ES 2 351 646 A1 31. Uso según cualquiera de las reivindicaciones 29 ó 30, donde el medicamento incluye al menos un excipiente farmacéuticamente aceptable. 32. Uso según cualquiera de las reivindicaciones 29 a 31, donde el medicamento incluye al menos un vehículo farmacéuticamente aceptable. 19 ES 2 351 646 A1 ES 2 351 646 A1 21 ES 2 351 646 A1 22 ES 2 351 646 A1 23 ES 2 351 646 A1 24 ES 2 351 646 A1 ES 2 351 646 A1 LISTA DE SECUENCIAS <110> Consejo Superior de Inventigaciones Científicas (CSIC) <120> Mamífero no humano modificado genéticamente, células y métodos para producirlas <130> 1641.392 <160> 7 <170> PatentIn version 3.5 <210> 1 <211> 615 <212> DNA <213> Mus musculus <400> 1 <210> 2 <211> 615 <212> DNA <213> Homo sapiens 1 <400> 2 <210> 3 <211> 19 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 3 ES 2 351 646 A1 ccattgaaga ttcttacac 19 <210> 4 <211> 19 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 4 tttcaagagc aggaatgtc 19 <210> 5 <211> 23 <212> DNA <213> Mus musculus <400> 5 tgaaacagga tcatgttgtg gag 23 <210> 6 <211> 20 <212> DNA <213> Mus musculus 2 <400> 6 ES 2 351 646 A1 caggaggagt ccaagaagac 20 <210> 7 <211> 23 <212> DNA <213> Mus musculus <400> 7 ataaaccctc ttgcagttgc atc 23 3 OFICINA ESPAÑOLA DE PATENTES Y MARCAS ESPAÑA