Inhibición de la secreción a partir de células no neuronales.

El uso de un agente para la fabricación de un medicamento para inhibir la secreción a partir de unacélula inflamatoria no neuronal,

dicho agente que comprende un primer, un segundo y un tercer dominiosen el que el primer dominio comprende una cadena ligera de la neurotoxina clostridial o un fragmento de la mismaque escinde una o más proteínas esenciales para la exocitosis,

el segundo dominio comprende un dominio de translocación seleccionado del grupo constituido por la porción HN dela cadena pesada de una toxina clostridial, un dominio de translocación de la toxina diftérica, el dominio detranslocación de la exotoxina A de Pseudomonas, un dominio de translocación fusógeno de la hemaglutinina delvirus de la gripe, un dominio de translocación del péptido anfifílico, y fragmentos de los mismos que producen latranslocación del primer dominio hacia la célula inflamatoria,

y el tercer dominio comprende una fracción de inserción dirigida que se une con una alta especificidad y/o afinidad aun Sitio de unión en la superficie de dicha célula inflamatoria no neuronal, en donde la fracción de inserción dirigidase selecciona del grupo constituido por anticuerpos, anticuerpos monoclonales, fragmentos de anticuerpos, lectinas,hormonas, citoquinas, factores de crecimiento, péptidos, carbohidratos, lípidos, glicones, y los componentes delcomplemento

Inhibición de la secreción a partir de células no neuronales

La presente invención se refiere a usos para el tratamiento de enfermedades mediante la inhibición de la secreción a partir de células inflamatorias no neuronales, y a sus agentes. La presente invención se refiere al tratamiento de enfermedades que dependen de la actividad citotóxica de células inflamatorias.

La exocitosis es la fusión de vesículas secretoras con la membrana plasmática y da como resultado la descarga del contenido de las vesículas : un proceso también conocido como secreción celular. La exocitosis puede ser constitutiva o regulada. Se cree que la exocitosis constitutiva se produce en todos los tipos celulares mientras que la exocitosis regulada ocurre en células especializadas.

La comprensión de los mecanismos involucrados en la exocitosis ha aumentado rápidamente, después de la propuesta de la hipótesis SNARE (Rothman, 1994, Nature 372, 55 – 63) . Esta hipótesis describe marcadores proteicos sobre las vesículas, que reconocen marcadores diana de membrana. Estos denominados SNARES cognados (denotados v-SNARE para las vesículas y t-SNARE para las dianas) facilitan el acoplamiento y la fusión de las vesículas con las membranas correctas, dirigiendo así la descarga de los contenidos vesiculares en el compartimiento apropiado. Para la comprensión de este proceso ha sido clave la identificación de las proteínas involucradas. Para la exocitosis se han identificado tres familias de proteínas SNARE : SNAP-25 y SNAP-23, y las sintaxinas son las familias t-SNARE sobre la membrana; y las VAMP (proteína de membrana asociada a vesículas) , que incluyen la sinaptobrevina y la celubrevina, son la familia v-SNARE sobre vesículas secretoras. Componentes clave de la maquinaria de fusión que incluyen las SNARE están involucrados tanto en la exocitosis regulada como constitutiva (De Camilli, 1993, Nature, 364, 387 – 388) .

Las neurotoxinas clostridiales son proteínas con pesos moleculares del orden de los 150 kDa. Son producidas por diversas especies del género Clostridium, principalmente C. tetani y varias cepas de C. botulinum. Actualmente existen ocho clases diferentes de neurotoxinas conocidas : la toxina del tétano y la neurotoxina botulínica en sus serotipos A, B, C1, D, E, F y G, y todas ellas comparten estructuras y modos de acción similares. Las neurotoxinas clostridiales son sintetizadas por las bacterias en forma de un único polipéptido que se modifica post-traduccionalmente para formar dos cadenas polipeptídicas unidas por un enlace disulfuro. Las dos cadenas se denominan cadena pesada (H) que tiene un peso molecular de aproximadamente 100 kDa y cadena ligera (LC) que tiene un peso molecular de aproximadamente 50 kDa. Las neurotoxinas clostridiales son altamente selectivas para las células neuronales, y se unen a ellas con una elevada afinidad [véase Black, J.D. y Dolly, J.O. (1987) Selective location of acceptors for BoNT/A in the central and peripheral nervous systems. Neuroscience, 23, pp. 767 – 779; Habermann, E. y Dreyer, F. (1986) Clostridial neurotoxins : handling and action at the cellular and molecular level. Curr. Top. Microbiol. Immunol. 129, pp. 93 – 179; y Sugiyama, H. (1980) Clostridium botulinum neurotoxin. Microbiol. Rev., 44, pp. 419 – 448 (y las referencias allí citadas) ].

Los requerimientos funcionales para la neurointoxicación por parte de las neurotoxinas clostridiales se pueden asignar a dominios específicos dentro de la estructura de la neurotoxina. Las neurotoxinas clostridiales se unen a un sitio aceptor sobre la membrana celular de la neurona motora en la sinapsis neuromuscular y, después de unirse al receptor altamente específico, son internalizadas mediante un mecanismo endocitótico. Se sabe que la actividad de unión específica de la sinapsis neuromuscular de las neurotoxinas clostridiales reside en el extremo carboxi-terminal del componente de la cadena pesada de la molécula bicatenaria de la neurotoxina, una región conocida como HC. Las neurotoxinas clostridiales internalizadas poseen una actividad endopeptidasa dependiente de cinc altamente específica que hidroliza un enlace peptídico específico en al menos una de las tres familias de proteínas, la sinaptobrevina, la sintaxina o la SNAP-25, que son componentes cruciales de la maquinaria neurosecretora. Se ha encontrado que la actividad endopeptidasa dependiente de cinc de las neurotoxinas clostridiales reside en la cadena ligera (LC) . La fracción amino-terminal del componente de la cadena pesada de la molécula bicatenaria de la neurotoxina, una región conocida como HN, es responsable de la translocación de la neurotoxina, o de una parte de ella que contiene la actividad endopeptidasa, a través de la membrana endosómica después de la internalización, permitiendo así el acceso de la endopeptidasa al citosol de la neurona y a su (s) proteína (s) sustrato. El resultado de la neurointoxicación es la inhibición de la liberación de neurotransmisores desde la neurona diana debido al impedimento de la liberación de los contenidos de la vesícula sináptica.

Aún no se ha caracterizado completamente el mecanismo mediante el cual el dominio HN lleva a cabo la translocación de la endopeptidasa hacia el citosol neuronal, pero se cree que implica un cambio conformacional, la inserción en la membrana endosómica y la formación de alguna forma de canal o poro a través del cual la endopeptidasa tiene acceso al citosol neuronal. Después de la unión a su receptor específico en la superficie neuronal, existen evidencias farmacológicas y morfológicas que indican que las neurotoxinas clostridiales entran en la célula por endocitosis [Black & Dolly (1986) J. Cell Biol. 103, 535 – 44] y a continuación deben pasar por una etapa a pH bajo para que se produzca la intoxicación de la neurona [Simpson y col. (1994) J. Pharmacol Exp. Ther., 269, 256 – 62]. El pH ácido no activa directamente la toxina mediante un cambio estructural, pero se cree que desencadena el proceso de la translocación de la membrana de la LC desde el lumen de la vesícula endosómica neuronal al citosol neuronal [Montecucco y col. (1994) FEBS Lett. 346, 92 – 98]. Existe un consenso general sobre el hecho de que canales determinados por la toxina están relacionados con el proceso de translocación hacia el citosol [Schiavo & Montecucco (1997) en Bacterial Toxins (ed. K. Aktories) ]. Este modelo requiere que el dominio HN forme un poro hidrófobo transmembrana a través de la membrana ácida de la vesícula que permita el paso de la LC parcialmente desplegada hacia el citosol. Se cree que el cambio conformacional necesario se desencadena por factores medioambientales en el compartimento endosómico neuronal hacia el cual se internaliza la neurotoxina, y una característica necesaria del dominio de unión de la HC es dirigir sitios de unión que permite la internalización en el compartimiento endosómico adecuado. Por tanto, las neurotoxinas clostridiales han evolucionado para dirigir restos de la superficie celular que cumplan este requerimiento.

Las hormonas son mensajeros químicos que son segregadas por las glándulas endocrinas del cuerpo. Ejercen acciones fisiológicas específicas sobre otros órganos a los que son transportados por la sangre. El espectro de procesos regulados por las hormonas incluye diversos aspectos de la homeostasis (por ejemplo, la insulina regula la concentración de glucosa en sangre) , el crecimiento (por ejemplo, la hormona del crecimiento promueve el crecimiento y regula el metabolismo de las grasas, carbohidratos y proteínas) , y la maduración (por ejemplo, las hormonas sexuales promueven la maduración sexual y la reproducción) . La hiperfunción endocrina produce estados patológicos provocados por cantidades excesivas de una hormona u hormonas en el torrente sanguíneo. Las causas de la hiperfunción se clasifican como neoplásicas, autoinmunitarias, iatrogénicas e inflamatorias. Los trastornos de hiperfunción endocrina son un grupo de enfermedades complejas, no solo debido a que existe un gran número de glándulas que pueden provocar una patología (por ejemplo, la pituitaria anterior, la pituitaria posterior, el tiroides, el paratiroides, la corteza adrenal, la médula adrenal, el páncreas, los ovarios, los testículos) sino porque muchas de las glándulas producen más de una hormona (por ejemplo, la pituitaria anterior produce corticotropina, prolactina, hormona luteinizante, hormona estimuladora de los folículos, hormona estimuladora del tiroides y gonadotropinas) . La mayoría de trastornos provocados por los excesos hormonales se deben al crecimiento neoplásico de células... [Seguir leyendo]

1. El uso de un agente para la fabricación de un medicamento para inhibir la secreción a partir de una célula inflamatoria no neuronal, dicho agente que comprende un primer, un segundo y un tercer dominios

en el que el primer dominio comprende una cadena ligera de la neurotoxina clostridial o un fragmento de la misma que escinde una o más proteínas esenciales para la exocitosis,

el segundo dominio comprende un dominio de translocación seleccionado del grupo constituido por la porción HN de la cadena pesada de una toxina clostridial, un dominio de translocación de la toxina diftérica, el dominio de translocación de la exotoxina A de Pseudomonas, un dominio de translocación fusógeno de la hemaglutinina del virus de la gripe, un dominio de translocación del péptido anfifílico, y fragmentos de los mismos que producen la translocación del primer dominio hacia la célula inflamatoria,

y el tercer dominio comprende una fracción de inserción dirigida que se une con una alta especificidad y/o afinidad a un Sitio de unión en la superficie de dicha célula inflamatoria no neuronal, en donde la fracción de inserción dirigida se selecciona del grupo constituido por anticuerpos, anticuerpos monoclonales, fragmentos de anticuerpos, lectinas, hormonas, citoquinas, factores de crecimiento, péptidos, carbohidratos, lípidos, glicones, y los componentes del complemento.

2. Uso según la reivindicación 1, para el tratamiento de enfermedades causadas, exacerbadas o mantenidas por la secreción de dicha célula inflamatoria no neuronal.

3. Uso según la reivindicación 1, en donde el tercer dominio comprende o consiste en un ligando seleccionado entre (i) para los mastocitos, receptores del complemento en general, incluyendo el dominio C4 de la Fc de IgE, y los anticuerpos/ligandos para el receptor del complemento C3a/C4a-R, (ii) para eosinófilos, anticuerpos/ligandos para el receptor del complemento C3a/C4a-R, anticuerpo monoclonal dirigido contra VLA-4, anticuerpo dirigido contra el receptor de IL-5, antígenos o anticuerpos reactivos al receptor del complemento CR4 (iii) para macrófagos y monocitos, factor estimulante de macrófagos, (iv) para macrófagos, monocitos y neutrófilos, LPS bacteriano y B-glucanos de levaduras que se unen a CR3, (v) para neutrófilos, anticuerpos para OX42, un antígeno asociado al receptor del complemento iC3b, o IL8, (vi) para fibroblastos, receptor de la manosa 6-fosfato/factor de crecimiento similar a la insulina (M6P/IGP-II) y PA2.26, anticuerpo para un receptor de la superficie celular para fibroblastos activos en ratones, y (vii) factores de crecimiento.

4. Uso según cualquiera de las reivindicaciones anteriores, para el tratamiento de una enfermedad seleccionada del grupo constituido por alergias (rinitis alérgica estacional (fiebre del heno) , conjuntivitis alérgica, rinitis vasomotora y alergia alimentaria) , eosinofilia, asma, artritis reumatoide, lupus eritematoso sistémico, lupus eritematoso discoide, colitis ulcerosa, enfermedad de Crohn, hemorroides, prurito, glomerulonefritis, hepatitis, pancreatitis, gastritis, vasculitis, miocarditis, psoriasis, eccema y fibrosis crónica inducida por radiación, cicatrización pulmonar y otros trastornos fibróticos.

5. Uso según cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en donde el agente comprende un primer dominio que escinde una proteína seleccionada entre SNAP-25, sinaptobrevina y sintaxina.

6. Uso según cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en el que el segundo dominio comprende una región HN de un polipéptido clostridial o un fragmento del mismo que produce la translocación de la actividad inhibidora de la exocitosis del primer dominio hacia la célula.

7. Uso según cualquiera de las reivindicaciones anteriores para la inhibición de la liberación constitutiva y regulada a partir de las células inflamatorias no neuronales.

8. Un agente para inhibir la secreción a partir de una célula inflamatoria no neuronal, que comprende al menos el primer, el segundo y el tercer dominio

en el que el primer dominio comprende una cadena ligera de la neurotoxina clostridial o un fragmento de la misma que escinde una o más proteínas esenciales para la exocitosis,

el segundo dominio comprende un dominio de translocación seleccionado del grupo constituido por la porción HN de la cadena pesada de una toxina clostridial, un dominio de translocación de la toxina diftérica, un dominio de translocación de la exotoxina A de Pseudomonas, un dominio de translocación fusógeno de la hemaglutinina del virus de la gripe, un dominio de translocación del péptido anfifílico, y fragmentos de los mismos que producen la translocación del primer dominio hacia la célula,

y el tercer dominio comprende una fracción de inserción dirigida que se une con una alta especificidad y/o afinidad a un Sitio de unión en la superficie de una célula inflamatoria no neuronal, en donde la fracción de inserción dirigida se selecciona del grupo constituido por anticuerpos, anticuerpos monoclonales, fragmentos de anticuerpos, lectinas, hormonas, citoquinas, factores de crecimiento, péptidos, carbohidratos, lípidos, glicones, y los componentes del complemento.

9. Un agente según la reivindicación 8, en donde el tercer dominio es como se define en la reivindicación

3.

10. Una composición farmacéutica que comprende un agente según la reivindicación 8 o 9 en combinación con un vehículo farmacéuticamente aceptable.

11. El uso de un agente según la reivindicación 8 o 9 o una composición farmacéutica según la reivindicación 10, para la fabricación de un medicamento para el tratamiento de una enfermedad causada, exacerbada o mantenida por la secreción de una célula inflamatoria no neuronal.

12. Una construcción de ácidos nucleicos que codifica un agente según la reivindicación 8 o 9, dicha construcción que comprende secuencias de ácidos nucleicos que codifican el primer, segundo y tercer dominios.

13. Una construcción de ácidos nucleicos según la reivindicación 12, unida de manera operable a secuencias promotoras y terminadoras, y opcionalmente a secuencias reguladoras, dichas secuencias promotoras, terminadoras y reguladoras que son funcionales en una célula diana inflamatoria no neuronal para llevar a cabo la expresión de dicho agente en dicha célula diana.

14. Un agente para su uso en terapia génica, que comprende :

(i) una secuencia de ácidos nucleicos que codifica un primer dominio que comprende una cadena ligera de una neurotoxina clostridial o un fragmento de la misma que escinde una o más proteínas esenciales para la exocitosis,

(ii) un segundo dominio asociado a la secuencia de ácidos nucleicos, en donde dicho segundo dominio comprende un dominio de translocación seleccionado del grupo constituido por la porción HN de la cadena pesada de una toxina clostridial, un dominio de translocación de la toxina diftérica, un dominio de translocación de la exotoxina A de Pseudomonas, un dominio de translocación fusógeno de la hemaglutinina del virus de la gripe, un dominio de translocación del péptido anfifílico, y fragmentos de los mismos, que, después de la administración del agente a un paciente, producen la translocación de la secuencia de ácidos nucleicos hacia la célula diana inflamatoria no neuronal en la que, cuando está presente en dicha célula diana inflamatoria no neuronal, la expresión de la secuencia de ácidos nucleicos se produce en ella; y

(iii) un tercer dominio que comprende una fracción de inserción dirigida que se une con una alta especificidad y/o afinidad a un sitio de unión en la superficie para determinar el direccionamiento del agente a dicha célula inflamatoria no neuronal, en donde la fracción de inserción dirigida se selecciona del grupo constituido por anticuerpos, anticuerpos monoclonales, fragmentos de anticuerpos, lectinas, hormonas, citoquinas, factores de crecimiento, péptidos, carbohidratos, lípidos, glicones, y los componentes del complemento.

15. Un agente según la reivindicación 14, en donde la secuencia de ácidos nucleicos está unida de manera operable a las secuencias promotoras y terminadoras, y opcionalmente a secuencias reguladoras, dichas secuencias promotoras, terminadoras y reguladoras que son funcionales en una célula diana inflamatoria no neuronal para llevar a cabo la expresión de dicho agente en dicha célula diana inflamatoria no neuronal.

16. Un agente según la reivindicación 14 o 15, en el que el tercer dominio es como se define en la reivindicación 3.

17. Uso de un agente según cualquiera de las reivindicaciones 14 – 16 para la fabricación de un medicamento para el tratamiento de una enfermedad causada, exacerbada o mantenida por la secreción a partir de una célula inflamatoria no neuronal.

18. Uso de una construcción de ácidos nucleicos según la reivindicación 12 ó 13 para la fabricación de un medicamento para el tratamiento de una enfermedad causada, exacerbada, o mantenida por la secreción a partir de

una célula inflamatoria no neuronal.