Método para producir un anticuerpo monoclonal de ratón humanizado,

que comprende las etapas siguientes:

(a) construir una primera librería de cadenas pesadas o ligeras humanizadas, en la que cada una de dichas cadenas tiene una secuencia de aminoácidos de la región 3 determinante de la complementariedad (CDR3) de una cadena pesada o ligera de ratón correspondiente, y en la que cada una de dichas cadenas incluye un dominio variable de origen humano;

(b) combinar la primera librería de cadenas pesadas o ligeras humanizadas construida de la etapa (a) con una cadena complementaria de un anticuerpo que se une a un antígeno preseleccionado, de forma que la cadena complementaria, junto con una cadena humanizada presente en la librería construida, forma un par de cadenas pesada y ligera en una librería de pares humanizados, en el que la cadena complementaria es una cadena quimérica de ratón/humana;

(c) seleccionar de la librería de pares humanizados de la etapa (b) un par particular de cadenas pesada y ligera humanizadas usando dicha cadena complementaria, en el que dicho par de cadenas pesada y ligera humanizadas se selecciona para la unión a dicho antígeno preseleccionado;

(d) construir una segunda librería de cadenas pesadas o ligeras humanizadas, en la que cada cadena tiene una secuencia de aminoácidos de CDR3 de ratón de una cadena pesada o ligera de ratón correspondiente, y en la que cada una de dichas cadenas incluye un dominio variable; en el que las cadenas de dicha segunda librería de cadenas pesadas o ligeras de anticuerpo humanizado son la cadena pesada o ligera complementaria de dichas cadenas de la primera librería de cadenas pesadas o ligeras de anticuerpo humanizado de la etapa (a), de manera que una librería es una librería de cadenas ligeras y la otra librería es una librería de cadenas pesadas;

(e) aislar una cadena pesada o ligera del par de cadenas pesada y ligera humanizadas de unión al antígeno de la etapa (c), y combinar dicha cadena de unión al antígeno con cadenas de dicha segunda librería de la etapa (d), de manera que la cadena de unión al antígeno, junto con las cadenas presentes en la librería construida de la etapa (d), forma un par de cadenas pesada y ligera en una librería de pares humanizados; y

(f) seleccionar de la librería de pares humanizados de la etapa (e) un par de cadenas y ligera humanizadas que se une a dicho antígeno preseleccionado.

Humanización de anticuerpo murino.

Campo técnico La presente invención se refiere a la humanización de anticuerpos murinos.

Antecedentes de la invención

Los anticuerpos comprenden típicamente dos cadenas pesadas enlazadas juntas mediante enlaces de disulfuro, y dos cadenas ligeras enlazadas a una cadena pesada respectiva mediante un enlace de disulfuro. Al comienzo de un extremo de cada cadena pesada existe un dominio variable, seguido de varios dominios constantes. De forma similar, cada cadena ligera tiene un dominio variable en un extremo, pero solamente un solo dominio constante en su otro extremo. Hay dos tipos de cadena ligera, que se denominan cadenas lambda (A) y kappa (K) . No se ha encontrado ninguna diferencia funcional entre anticuerpos que tienen cadenas ligeras A o K. Sin embargo, la relación de los dos tipos de cadena ligera varía de una especie a otra. En ratones, la relación K:A es 20:1, mientras que en seres humanos es 2:1.

Los dominios variables de las cadenas ligera y pesada están alineados, como lo está el dominio constante de la cadena ligera y el primer dominio constante de la cadena pesada. Los dominios constantes en las cadenas ligera y pesada no están involucrados directamente en la unión del anticuerpo al antígeno.

Son los dominios variables los que forman el sitio de unión de los anticuerpos al antígeno. La estructura general de cada dominio de las cadenas ligera y pesada comprende un armazón de cuatro regiones, cuyas secuencias están relativamente conservadas, conectadas por tres regiones que determinan la complementariedad (CDR) . Las cuatro regiones de armazón emplean una conformación de lámina beta, y las CDR forman bucles que conectan, y en algunos casos forman parte de, la estructura de lámina beta. Las CDR se mantienen en estrecha proximidad mediante las regiones de armazón, y, con las CDR del otro dominio, contribuyen a la formación del sitio de unión al antígeno.

Aunque los antígenos de la superficie celular de células tumorales son las dianas tradicionales para la terapia contra el cáncer guiada por anticuerpos, una de las limitaciones principales para la terapia de tumores sólidos es la baja accesibilidad de los antígenos tumorales a los anticuerpos que circulan en el torrente sanguíneo. El empaquetamiento denso de las células tumorales y la elevada presión intersticial en el núcleo tumoral presentan barreras físicas formidables.

Una solución al problema de la mala penetración de los anticuerpos en tumores sólidos sería atacar a las células endoteliales que forran los vasos sanguíneos del tumor, en vez de a las propias células tumorales. Aunque puede ser difícil dirigirse específicamente a la vasculatura tumoral madura, es decir, sin destruir el tejido sano, estrategias prometedoras apuntan a la inhibición de la neovascularización.

La neovascularización, también denominada angiogénesis, es inducida por citocinas que son segregadas a partir de células tumorales, y depende de la migración e invasión de células vasculares, procesos regulados por moléculas de adhesión celular (CAM) y por proteasas. Estas moléculas se consideran actualmente como dianas potenciales para los inhibidores angiogénicos. A este respecto, la integrina vascular avº3 se ha identificado recientemente como un marcador de vasos sanguíneos angiogénicos. Véase Brooks, P.C., et al. (1994) , REQUIREMENT OF INTEGRIN avº3 FOR ANGIOGENESIS, Science 264, 569-571. Además, se demostró que el anticuerpo monoclonal (mAb) de ratón LM609 dirigido contra integrina avº3 fue capaz de suprimir la angiogénesis, indicando que la integrina avº3 tiene un papel crítico en la angiogénesis.

Se ha demostrado además que LM609 promueve selectivamente la apoptosis de células vasculares que han sido estimuladas a sufrir angiogénesis. Véase Brooks, P.C., et al. (1994) , INTEGRIN avº3 ANTAGONISTS PROMOTE TUMOR REGRESSION BY INDUCING APOPTOSIS OF ANGIOGENIC BLOOD VESSELS, Cell 79, 1157-1164. Estos hallazgos sugieren que la integrina avº3 puede ser una diana, y LM609 una herramienta para el diagnóstico y terapia del cáncer.

De hecho, LM609 no sólo evitó el crecimiento de tumores humanos histológicamente bien definidos implantados en membranas corioalantoicas de embriones de pollo, sino también indujo su regresión. Véase Cell 79, 1157-1164. Usando un modelo clínicamente más pertinente de crecimiento tumoral, se encontró que LM609 bloqueó el crecimiento de cáncer de mama humano en un modelo quimérico de ratón SCID/humano. De forma importante, LM609 no sólo bloqueó el crecimiento tumoral, sino también inhibió la metástasis de los carcinomas de mama examinados. Véase Brooks, et al. (1995) ANTI-INTEGRIN avº3 BLOCKS HUMAN BREAST CANCER GROWTH AND ANGIOGENESIS IN HUMAN SKIN, J. Clin. Invest. 96, 1815-1822.

Los resultados de Brooks et al. son consistentes con estudios previos que han sugerido que la angiogénesis contribuye a la diseminación metastásica de células de tumor de mama. Véase Weidner, N., et al. (1991) TUMOR ANGIOGENESIS AND METASTASIS: CORRELATION IN INVASIVE BREAST CARCINOMA, N. Engl. J. Med. 324, 1-8; y Weidner, N., et al. (1992) TUMOR ANGIOGENESIS: A NEW SIGNIFICANT AND INDEPENDENT PROGNOSTIC INDICATOR IN EARLY-STAGE BREAST CARCINOMA, J. Natl. Cancer Inst. 84, 1875-1887.

En los últimos años, se han presentado pruebas de que existen dos rutas de angiogénesis dependientes de citocinas, y que están definidas por su dependencia de integrinas vasculares bien claras. Véase Friedlander, M., et al. (1995) DEFINITION OF TWO ANGIOGENIC PATHWAYS BY DISTINCT AV INTEGRINS, Science 270, 15001502. Los resultados de los estudios de Friedlander et al. muestran que el anticuerpo LM609 anti-av 3 bloqueó la angiogénesis en respuesta a bFGF y TNFa, aunque tiene poco efecto sobre la angiogénesis inducida por VEGF, TGFa, o éster de forbol PMA. Por el contrario, el anticuerpo P1F6 anti-av 5 bloquea la angiogénesis inducida por VEGF, TGFa, y el éster de forbol PMA, aunque tiene efectos mínimos sobre la inducida por bFGF o TNFa.

De este modo, es concebible que los tumores que muestran menos susceptibilidad a anticuerpos anti-av 3 pueden segregar citocinas que promueven la angiogénesis de una manera dependiente de av 5. Tomados en conjunto, tanto los anticuerpos anti-av 3 como anti-av 5 son herramientas prometedoras para el diagnóstico y la terapia del cáncer.

Sin embargo, los anticuerpos monoclonales de ratón, tales como LM609, son muy inmunógenos en seres humanos, limitando así su uso potencial para la terapia contra el cáncer, especialmente cuando es necesaria una administración repetida. Para reducir la inmunogenicidad de anticuerpos monoclonales de ratón, se generaron anticuerpos monoclonales quiméricos, fusionándose los dominios de Ig variables de un anticuerpo monoclonal de ratón a los dominios de Ig constantes de ser humano. Véanse Morrison, S.L., et al. (1984) CHIMERIC HUMAN ANTIBODY MOLECULES; MOUSE ANTIGEN-BINDING DOMAINS WITH HUMAN CONSTANT REGION DOMAINS, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 81, 6841-6855; y Boulianne, G.L., et al. (1984) PRODUCTION OF A FUNCTIONAL CHIMAERIC MOUSE/HUMAN ANTIBODY, Nature 312, 643-646. Este proceso se denomina habitualmente como “humanización” de un anticuerpo.

En general, los anticuerpos monoclonales quiméricos retienen la especificidad de unión del anticuerpo monoclonal de ratón, y muestran interacciones mejoradas con células efectoras humanas. Esto da como resultado una citotoxicidad celular mejorada dependiente de anticuerpos que se supone que es una de las vías para eliminar células tumorales usando anticuerpos monoclonales. Véase Morrison, S.L. (1992) IN VITRO ANTIBODIES: STRATEGIES FOR PRODUCTION AND APPLICATION, Ann. Rev. Immunol. 10, 239-265. Aunque algunos anticuerpos monoclonales quiméricos han demostrado ser menos inmunógenos en seres humanos, los dominios de Ig variables de ratón todavía pueden conducir a una respuesta anti-ratón significativa del ser humano. Véase Bruggemann, M., et al. (1989) THE IMMUNOGENICITY OF CHIMERIC ANTIBODIES. J. Exp. Med. 170, 2153-2157. Por lo tanto, para los fines terapéuticos, puede ser necesario humanizar completamente un anticuerpo monoclonal murino alterando tanto los dominios de Ig variables como constantes.

La patente US nº 5.565.332 describe métodos para la producción de anticuerpos con mayores características humanas con respecto a un anticuerpo progenitor usando cadenas ligeras humanas sin tratamiento previo.

La humanización completa es factible introduciendo las seis CDR de los dominios de Ig... [Seguir leyendo]

1. Método para producir un anticuerpo monoclonal de ratón humanizado, que comprende las etapas siguientes:

(a) construir una primera librería de cadenas pesadas o ligeras humanizadas, en la que cada una de dichas cadenas tiene una secuencia de aminoácidos de la región 3 determinante de la complementariedad (CDR3) de una cadena pesada o ligera de ratón correspondiente, y en la que cada una de dichas cadenas incluye un dominio variable de origen humano;

(b) combinar la primera librería de cadenas pesadas o ligeras humanizadas construida de la etapa (a) con una cadena complementaria de un anticuerpo que se une a un antígeno preseleccionado, de forma que la cadena complementaria, junto con una cadena humanizada presente en la librería construida, forma un par de cadenas pesada y ligera en una librería de pares humanizados, en el que la cadena complementaria es una cadena quimérica de ratón/humana;

(c) seleccionar de la librería de pares humanizados de la etapa (b) un par particular de cadenas pesada y ligera humanizadas usando dicha cadena complementaria, en el que dicho par de cadenas pesada y ligera humanizadas se selecciona para la unión a dicho antígeno preseleccionado;

(d) construir una segunda librería de cadenas pesadas o ligeras humanizadas, en la que cada cadena tiene una secuencia de aminoácidos de CDR3 de ratón de una cadena pesada o ligera de ratón correspondiente, y en la que cada una de dichas cadenas incluye un dominio variable; en el que las cadenas de dicha segunda librería de cadenas pesadas o ligeras de anticuerpo humanizado son la cadena pesada o ligera complementaria de dichas cadenas de la primera librería de cadenas pesadas o ligeras de anticuerpo humanizado de la etapa (a) , de manera que una librería es una librería de cadenas ligeras y la otra librería es una librería de cadenas pesadas;

(e) aislar una cadena pesada o ligera del par de cadenas pesada y ligera humanizadas de unión al antígeno de la etapa (c) , y combinar dicha cadena de unión al antígeno con cadenas de dicha segunda librería de la etapa (d) , de manera que la cadena de unión al antígeno, junto con las cadenas presentes en la librería construida de la etapa (d) , forma un par de cadenas pesada y ligera en una librería de pares humanizados; y

(f) seleccionar de la librería de pares humanizados de la etapa (e) un par de cadenas y ligera humanizadas que se une a dicho antígeno preseleccionado.

2. Método según la reivindicación 1, en el que la librería humanizada de la etapa (a) contiene cadenas ligeras, y la cadena complementaria de la etapa (b) es una cadena pesada.

3. Método según la reivindicación 1, en el que la librería humanizada de la etapa (a) contiene cadenas pesadas, y la cadena complementaria de la etapa (b) es una cadena ligera.

4. Método según la reivindicación 1, en el que la cadena pesada es un fragmento Fd.

5. Método para humanizar un anticuerpo monoclonal de ratón, que comprende las etapas siguientes:

(a) construir una librería de cadenas ligeras humanizadas, en la que cada una de dichas cadenas ligeras comprende por lo menos un dominio variable de la misma y tiene una secuencia de aminoácidos de CDR3 de ratón de una cadena ligera de ratón;

(b) seleccionar de la librería de cadenas ligeras humanizadas construida una cadena ligera humana que tiene una CDR3 de ratón, en el que la selección comprende usar una cadena pesada de un anticuerpo que se une a un antígeno preseleccionado, en el que la cadena pesada es una cadena quimérica de ratón/humana, y en el que dicha cadena ligera humana que tiene una CDR3 de ratón se selecciona para la unión a un antígeno preseleccionado;

(c) construir una librería de cadenas pesadas humanizadas, en la que cada una de dichas cadenas pesadas comprende por lo menos un dominio variable humano, y tiene una secuencia de aminoácidos de CDR3 de ratón de una cadena pesada de ratón;

(d) combinar la librería de cadenas pesadas humanizadas construida con la cadena ligera humanizada seleccionada, para producir una librería humanizada de pares de cadenas pesada y ligera que contienen cada uno una CDR3 de ratón; y

(e) seleccionar de la librería humanizada de la etapa (d) un par de cadenas pesada y ligera usando la cadena ligera humana seleccionada, en el que dicho par de cadenas pesada y ligera se selecciona para la unión al antígeno preseleccionado.

6. Método según la reivindicación 5, que comprende además convertir el par de cadenas pesada y ligera seleccionado en anticuerpo completo.

7. Método según la reivindicación 5, en el que la cadena pesada es Fd. 5

8. Método según la reivindicación 7, en el que el Fd es un miembro del grupo que consiste en un fragmento de cadena pesada de ratón/humana quimérico y un fragmento molde de cadena pesada de ratón.

9. Método según la reivindicación 5, en el que sólo está presente en la cadena ligera humana una región tres 10 determinante de la complementariedad de la cadena ligera procedente del anticuerpo LM609.

10. Método según la reivindicación 5, en el que sólo está presente en la cadena pesada humana una región tres determinante de la complementariedad de la cadena pesada procedente del anticuerpo LM609.

11. Método según la reivindicación 7, en el que el Fd es una cadena pesada quimérica de ratón/humana.

12. Método según la reivindicación 7, en el que el Fd es un fragmento molde de la cadena pesada de ratón.