Un procedimiento para la detección de la preñez en un bovino, que comprende:

medir el nivel de una glicoproteína asociada con la preñez (PAG) en una muestra obtenida de dicho bovino, en el que dicho nivel de PAG comprende una mezcla de PAG-4, PAG-6, PAG-9, PAG-16, PAG-18, PAG-19 y Mon PAG, que están presentes en una fracción de proteína ácida derivable de tejido de placenta desde el día 55 al día 60 de dicho bovino, en el que una elevación en dicho nivel de PAG indica que dicho bovino está preñado.

Fracción PGA-55-60 enriquecida y procedimientos para la detección precoz de preñez en animales ungulados.

Antecedentes de la invención

I. Campo de la invención

La presente invención se refiere, en general, a los campos de la medicina veterinaria, biología reproductora y diagnósticos. Más específicamente, la presente invención se refiere a procedimientos mejorados para una detección precisa de la gestación en ungulados (animales con pezuña) , incluidos rumiantes como bovinos (p. ej., ganado bovino para leche y para carne) y ovinos. La presente invención también se refiere a anticuerpos, incluidos anticuerpos policlonales que se han generado usando la fracción de proteína enriquecida PAG-55 como inmunógeno.

II. Descripción de la técnica relacionada

El diagnóstico de preñez es un componente importante en la gestión buena de la reproducción, en particular en la industria láctea (Oltenacu et al., 1990) , en la que una proporción elevada de inseminaciones artificiales fallan (Streenan y Diskin, 1986) . Durante tiempo se ha estado buscando una prueba de preñez fiable aunque simple para rumiantes, como ganado bovino. Se dispone de varios procedimientos, incluido un ensayo de progesterona en leche (Oltenacu y col., 1990; Markusfeld y col., 1990) , análisis de sulfato de estrona (Holdsworth y col., 1982; Warnick y col., 1995) , palpación rectal (Hatzidakis y col., 1993) , ecografía (Beal y col., 1992; Cameron y Malmo, 1993) , y análisis de sangre para detectar antígenos específicos de preñez. De estos, el ensayo de progesterona en leche es el más rentable para el productor (Oltenacu y col., 1990; Markusfeld y col., 1990) . El siguiente es la palpación rectal, realizado a los 50 días de la inseminación (Oltenacu y col., 1990) .

Aunque los procedimientos anteriores para el diagnóstico de preñez son potencialmente útiles, todos ellos han fallado en las expectativas en términos de su uso práctico en la granja. Por ejemplo, las determinaciones de la progesterona en leche o suero alrededor del día 18-22 da resultados inaceptablemente altos de falsos positivos (Oltenacu y col., 1990; Markusfeld y col., 1990) . La presencia de sulfato de estrona en orina o suero proporciona otra prueba, pero solo es útil tras el día 100 cuando las concentraciones aumentan (Holdsworth y col., 1982; Warnick y col., 1995) .

El descubrimiento de la proteína B específica de preñez (Butler y col., 1982) ha proporcionado un nuevo enfoque al diagnóstico de preñez, ya que podría detectarse en la sangre de vacas preñadas a la cuarta semana de preñez (Sasser y col., 1986; Humblot y col., 1988) . Otros dos grupos han desarrollado inmunoensayos que se pueden basar en un antígeno idéntico o inmunológicamente similar (Zoli y col., 1992a; Mialon y col., 1993; Mialon y col., 1994) . En un caso, el antígeno (Mr 67 kDa) se denominó glicoproteína asociada con la preñez bovina (boPAG; ahora boPAG1) (Zoli y col., 1991, 1992a, 1992b) ; en el segundo, se diseñó como proteína 60 sérica de la gestación (PSP60) (Mialon y col., 1993; Mialon y col., 1994) . El término PAG se refiere, en general, a glicoproteínas asociadas con la gestación o a antígenos asociados a la preñez. Para una revisión reciente de los procedimientos y una caracterización de los miembros actuales de las boPAG, véase Green y col., Theriogenology 63:1481-1503 (2005) , incorporado en el presente documento por referencia en su totalidad.

El inmunoensayo para PSP-B/boPAG1/PSP60 tiene varias ventajas. En primer lugar, puede detectar una preñez relativamente pronto. En segundo lugar, la interpretación de los ensayos no requiere el conocimiento de la fecha exacta del servicio, ya que las moléculas de boPAG-1 inmunorreactivas siempre están presentes en el suero materno de vacas gestantes el día 28, y las concentraciones aumentan a medida que progresa la preñez (Sasser y col., 1986; Mialon y col., 1993; Mialon y col., 1994) .

No obstante, este procedimiento tiene dos desventajas principales. En primer lugar, el diagnóstico positivo en la cuarta semana de preñez sigue siendo algo incierto porque las concentraciones del antígeno en sangre son bajas y algo variables. En segundo lugar, las concentraciones de boPAG1 se elevan considerablemente a término (Sasser et al., 1986; Zoli et al., 1992a; Mialon y col., 1993) y, debido a la larga semivida en circulación de la molécula (Kiracofe y col., 1993) , el antígeno sigue pudiéndose detectar 80-100 días después del parto (Zoli y col., 1992a; Mialon y col., 1993; Mialon y col., 1994; Kiracofe y col., 1993) , lo que compromete el diagnóstico de preñez en vacas criadas en el periodo posparto temprano. Por tanto, la prueba se puede llevar a cabo en vacas de leche el día 30 tras la inseminación artificial (IA) únicamente si la IA se ha realizado a los 80 o más días del parto.

Existe una necesidad general de procedimientos fáciles, económicos, sensibles, no invasivos y precisos, y pruebas para detectar los analitos de la preñez en muestras de sangre entera, especialmente los que no requiere ningún equipamiento o sustancias químicas especiales. Estos procedimientos serían particularmente útiles en el escenarios de campo o rurales en los que el equipamiento, de laboratorio, los productos químicos y almacenamiento refrigerado no están disponibles.

Específicamente, existe la necesidad en la técnica de una prueba de preñez que se lleve a cabo de un modo fiable y pronto durante la preñez, que podría proporcionar una indicación definitiva en cuanto a si se requiere volver a criar o sacrificar. En general, la IA (inseminación artificial) tiene éxito menos del 50 % de las veces en ganado vacuno y el productor debe depender de las señales abiertas de comportamiento de retorno al estro (que pasan fácilmente inadvertidas) o retrasar la recría hasta que se confirme el fallo de preñez mediante uno de los procedimientos descritos anteriormente. Dichos retrasos son extremadamente costosos y constituyen una pérdida económica importante para la industria.

Específicamente, en la técnica existe la necesidad de generar una prueba de preñez precisa para ungulados que use sangre entera, que se puede extraer fácilmente del animal. Ser capaz de usar una muestra de sangre entera sin un equipo o tratamiento químico especial facilitaría una detección fiable y precoz de la gestación y permitiría adoptar medidas eficientes cuando se requiere recría o retirada.

Las pruebas de preñez por inmunodetección rutinarias implican la detección de un analito en suero sanguíneo. Los procedimientos anteriores para usar suero de sangre entera para este tipo de pruebas implican componentes físicos

o matrices adicionales, tales como filtros, fibras de vidrio, agentes absorbentes, papel, vellón, celulosa, lana, fibras de asbestos o una o múltiples etapas de centrifugación necesarias o requieren la adición de agentes químicos, tales como anticuerpos anti-glóbulos rojos, polilisina o lectinas.

La sangre entera se obtiene fácilmente de mamíferos, incluidos animales de granja; no obstante, la separación de los constituyentes que interfiere, como los glóbulos rojos, del suero deseado puede suponer un problema en el campo, incluido en las granjas. Por tanto, existe la necesidad de un procedimiento fácil que no requiera filtros, matrices o etapas de centrifugación adicionales y que permita el uso de sangre entera coagulada para detectar cualquier analito deseado del preñez en suero usando diversas pruebas adecuadas, tales como inmunodetección.

En consecuencia, existe la necesidad de una prueba de preñez factible, económica, sensible, no invasiva y precisa para ganado vacuno y otros rumiantes, que tenga niveles bajos de falsos positivos y siga siendo lo bastante sensible para detectar la preñez (o más propiamente dicho la ausencia de la misma) lo bastante pronto como para que el mayoral de rebaño identifique las vacas no gestantes (”abiertas") para recría.

Sumario de la invención

La invención proporciona procedimientos para la detección de preñez en un bovino, que comprende medir el nivel de una glicoproteína asociada con la preñez (PAG) en una muestra obtenida de dicho bovino, en los que dicho nivel de PAG comprende PAG-4, PAG-6, PAG-9, PAG-16, PAG-18, PAG-19 y Mon PAG, que están presentes en una fracción de proteína ácida derivable de tejido de placenta desde el día 55 al día 60 de dicho bovino, en los que una elevación en dicho nivel de PAG indica que dicho bovino está preñado. Este procedimiento... [Seguir leyendo]

1. Un procedimiento para la detección de la preñez en un bovino, que comprende:

medir el nivel de una glicoproteína asociada con la preñez (PAG) en una muestra obtenida de dicho bovino, en el que dicho nivel de PAG comprende una mezcla de PAG-4, PAG-6, PAG-9, PAG-16, PAG-18, PAG-19 y Mon PAG, que están presentes en una fracción de proteína ácida derivable de tejido de placenta desde el día 55 al día 60 de dicho bovino, en el que una elevación en dicho nivel de PAG indica que dicho bovino está preñado.

2. El procedimiento de la reivindicación 1, que además comprende medir el nivel de progesterona en dicha muestra y en el que un nivel elevado de dicha progesterona indica además que dicho bovino está preñado.

3. El procedimiento de la reivindicación 1 o 2, en el que dicha muestra es saliva, suero, plasma, sangre, leche u orina.

4. El procedimiento de acuerdo con la reivindicación 1 o 2, en el que la muestra es sangre entera.

5. El procedimiento de la reivindicación 4, que además comprende:

(i) dejar que la sangre entera coagule en presencia de un activador de la coagulación;

(ii) dejar que el suero salga de la sangre entera coagulada sin centrifugar; y

(iii) colocar el suero extruido en comunicación líquida con medios de detección que comprende un reactante que es indicativo de la preñez

6. El procedimiento de la reivindicación 5, en el que el activador de la coagulación se selecciona del grupo que consiste en trombina, fosfolípidos, caolín, sílice micronizada y calcio.

7. El procedimiento de la reivindicación 1 o 2, en el que dicha muestra se obtiene de dicho bovino cualquier día desde el día 15 al día 30 tras la inseminación.

8. El procedimiento de una cualquiera de las reivindicaciones 1-7, en el que el bovino es una vaca.

9. El procedimiento de una cualquiera de las reivindicaciones 1-8, en el que dicha medición comprende detección inmunológica.

10, El procedimiento de la reivindicación 9, en el que dicha detección inmunológica comprende usar antisuero policlonal, una preparación de anticuerpos policlonales o fragmentos de unión a antígeno de anticuerpos policlonales.

11. El procedimiento de la reivindicación 9, en el que la detección inmunológica comprende usar una preparación de anticuerpos monoclonales.

12. El procedimiento de la reivindicación 9, en el que dicha detección inmunológica comprende ELISA, RIA, tiras de ensayo basadas en tecnología de flujo lateral o transferencia Western.

13. El procedimiento de la reivindicación 12, en el que dicho ELISA es un ELISA sándwich que comprende formar un inmunocomplejo entre una de las PAG en dicha muestra y una primera preparación de anticuerpo fijada a un sustrato y unir al inmunocomplejo una segunda preparación de anticuerpo marcada con una enzima.

14. El procedimiento de la reivindicación 13, en el que la enzima es fosfastasa alcalina, peroxidasa de rábano o acetilcolinesterasa.

15. El procedimiento de una cualquiera de las reivindicaciones 1, 2 o 7-14, en el que la muestra es suero y en el que el nivel de PAG en suero es superior a 0, 0 ng/ml.

16. El procedimiento de la reivindicación 15, en el que el nivel de PAG es de 1, 0 ng/ml a 5 ng/ml.

17. El procedimiento de la reivindicación 15, en el que el nivel de PAG es de 2, 0 ng/ml a 3, 0 ng/ml.

18. El procedimiento de una cualquiera de reivindicación 1 i 2, en el que dicha medición comprende hibridación de ácido nucleico.

19. El procedimiento de la reivindicación 18, en el que dicha hibridación de ácido nucleico comprende transferencia Northern o amplificación.

20. El procedimiento de la reivindicación 19, en el que dicha amplificación comprende RT-PCR.

21. El procedimiento de la reivindicación 2, en el que medir los niveles de progesterona comprende detección

inmunológica.

22. El procedimiento de una cualquiera de las reivindicaciones 2 o 7-17, en el que la muestra es suero y en el que el nivel elevado de progesterona en suero es superior a 2 ng/ml.

23. El procedimiento de la reivindicación 22, en el que el nivel de progesterona es de 3 ng/ml.

24. El procedimiento de la reivindicación 2, en el que medir los niveles de progesterona que comprende medir los niveles enzimáticos de la vía de la biosíntesis de la progesterona mediante hibridación de ácido nucleico, detección inmunológica o medición de la actividad enzimática.

25. El procedimiento de una cualquiera de las reivindicaciones 2 o 7-17, en el que dicha muestra es suero y se obtiene desde los dí.

2. 30 tras la inseminación del animal y los niveles de PAG y progesterona en suero son de al menos 0, 5 a 30 ng/ml y de 2 a 5 ng/ml, respectivamente.

26. El procedimiento de la reivindicación 25, en el que el nivel de PAG es de al menos1, 0 ng/ml a 5, 0 ng/ml.

27. El procedimiento de la reivindicación 25, en el que el nivel de PAG es de al menos 2, 0 ng/ml a 3, 0 ng/ml.

28. El procedimiento de una cualquiera de las reivindicaciones 2 o 7-17, en el que dicha muestra es suero y se obtiene los día.

2. 30 tras la inseminación del bovino y los niveles de PAG y progesterona en suero son de al menos 02 ng/ml.

29. El procedimiento de la reivindicación 1 o 2, que además comprende obtener una muestra de control positivo de un bovino preñado.

30. El procedimiento de la reivindicación 1 o 2, que además comprende obtener una muestra de control negativo de un bovino preñado.

31. El procedimiento de la reivindicación 2, que además comprende medir los niveles de PAG y progesterona de una segunda muestra de dicho bovino en un segundo punto de tiempo.

32. Un procedimiento de tomar una decisión sobre la cría para bovinos con sospecha de estar preñados, que comprende:

medir el nivel de una glicoproteína asociada a la preñez (PAG) en una muestra obtenida de dicho bovino que se sospecha que está preñado.

en el que dicho nivel de PAG comprende una mezcla de PAG-4, PAG-6, PAG-9, PAG-16, PAG-18, PAG-19 y Mon PAG, que están presentes en una fracción proteica ácida derivable desde el tejido placentario del día 55 al día 60 de dicho bovino;

en el que:

(i) un nivel elevado de PAG indica que dicho bovino está preñado, o

(ii) un nivel no elevado de PAG indica que dicho bovino no está preñado y deberá recibir terapia hormonal de seguimiento para la recría,

33. El procedimiento de la reivindicación 32, en el que dicha terapia hormonal de la condición (ii) comprende inyectar al bovino la hormona liberadora de gonadotropina (GnRH) y, siete días después, inyectar prostaglandina F2α (PGF) , seguido de la re-inseminación.

34. El procedimiento de la reivindicación 32, que además comprende:

(c) medir el nivel de progesterona en dicha muestra, en el que:

(iii) niveles elevados de PAG y progesterona indican que dicho bovino está preñado;

(iv) niveles no elevados de PAG indican que dicho bovino no está preñado y deberá recibir terapia hormonal de seguimiento para la recría,

(v) un nivel elevado de PAG y un nivel no elevado de progesterona indican que dicho bovino no está preñado debido a un embrión no viable y deberá recibir terapia hormonal de seguimiento para la recría,

(vi) un nivel no elevado de PAG y un nivel elevado de progesterona indican que dicho bovino no está preñado y deberá recibir terapia hormonal de seguimiento para la recría,

35. El procedimiento de la reivindicación 34, en el que dicha terapia hormonal de la condición (iv) comprende inyectar al bovino la hormona liberadora de gonadotropina (GnRH) y, siete días después, inyectar prostaglandina F2α

(PGF) , seguido de la re-inseminación.

36. El procedimiento de la reivindicación 34, en el que dicha terapia hormonal de la condición (v) comprende inyectar al bovino GnRH y, siete días después, inyectar PGF, seguido de la re-inseminación.

37. El procedimiento de la reivindicación 34, en el que dicha terapia hormonal de la condición (vi) comprende inyectar al bovino PGF, seguido de la re-inseminación.

38. El procedimiento de la reivindicación 35 o 36, en el que dicha terapia hormonal de la condición (iv) o (v) comprende además administrar una segunda inyección de GnRH 48 horas después de la inyección de PGF.

39. El procedimiento de la reivindicación 34, que además comprende inseminar a dicho bovino antes de medir el nivel de PAG.

40. El procedimiento de la reivindicación 35, 36 o 37, en el que dicha inyección de PGF se administra el día 20 tras la inseminación y en el que la re-inseminación se lleva a cabo el día 28 tras la inseminación.

41. El procedimiento de la reivindicación 35, 36 o 37, en el que dicha inyección de PGF se administra el día 26 tras la inseminación y en el que la re-inseminación se lleva a cabo el día 28 tras la inseminación.

42. Una fracción proteica ácida aislada purificada de placentas bovinas del día 55 al día 60, que comprende una mezcla de PAG-4, PAG-6, PAG-9, PAG-16, PAG-18, PAG-19 y Mon PAG.

43. Un procedimiento de aislar una fracción proteica que comprende una mezcla de PAG-4, PAG-6, PAG-9, PAG-16, PAG-18, PAG-19 y Mon PAG, que comprende:

a) preparar un homogeneizado de la placenta bovina desde el día 55 al 60: b) realizar cromatografía de afinidad a un pH ácido con dicho homogeneizado y recoger los eluatos ácidos de la misma; y

c) someter a los eluatos ácidos a cromatografía de filtración en gel y recoger los filtrados; en el que dichos filtrados comprenden dicha fracción proteica.

44. El procedimiento de la reivindicación 32, en el que dicha terapia hormonal de la condición (ii) comprende inyectar al bovino PGF, seguido de la re-inseminación.

45. El procedimiento de la reivindicación 1, que comprende medir el nivel de una mezcla de proteínas PAG-4, PAG6, PAG-9, PAG-16, PAG-18, PAG-19 y Mon PAG en una muestra, en el que una elevación del nivel de dichas proteínas indica que el bovino está preñado.

46. El procedimiento de la reivindicación 45, en el que la muestra es suero, plasma o sangre entera.

47. El procedimiento de la reivindicación 45 o 46, en el que dicha medición se realiza con un anticuerpo policlonal producido contra una fracción proteica ácida derivada de tejido placentario bovino del día 55 al día 60 y que comprende una mezcla de PAG-4, PAG-6, PAG-9, PAG-16, PAG-18, PAG-19 y Mon PAG.